Etude des chromosomes somatiques humains technique de culture de fibroblastes in vitro

J. LEJEUNE, R. TURPIN et M. GAUTIER.

Revue française d'études cliniques et biologiques. 1960, vol. V, 406-408.


Résumé :

La technique d'étude des chromosomes somatiques humains est étudiée. Le Prélèvement tissulaire porte sur les aponévroses périmusculaires, la mise en culture et la composition du milieu de culture sont détaillées, les mitoses e prophases tardives et prométaphases sont obtenues sans addition de colchicine.Les techniques de dispersion des chromosomes, de fixation d'aplatissement des préparations et de coloration sont exposées.Les observations chromosomiques sont effectuées sur photographies.

Sommaire

Le rapide essor des études chromosomiques humaines, et plus spécialement la recherche d'anomalies chromosomiques déterminant des maladies constitutionnelles (dont le premier exemple est la trisomie Vh du mongolisme, Lejeune, Gautier, Turpin, 1959) (1) ont rendu nécessaire l'emploi de techniques de cultures cellulaires fidèles, aussi simples que possible.

La présente note est destinée à décrire la méthode mise au point dans notre laboratoire et qui a pour avantage principal de ne nécessiter aucun appareillage particulier.

Dans la description qui va suivre il est sous-entendu que toutes les manipulations précédant la fixation des préparations doivent être effectuées avec une asepsie absolue. L'emploi d'une hotte spéciale, stérilisée aux U. V., est recommandable, mais n'est pas indispensable. Par contre, toutes les manipulations doivent être faites à proximité d'un bec Bunsen permettant de stériliser sur-le-champ instruments et verrerie qui pourraient avoir été souillés.

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A. Prélèvement

D'une façon générale, tout tissu, prélevé stérilement, est susceptible de donner des cultures utilisables. Cependant l'expérience nous a montré que le tissu conjonctif pousse plus vite que tout autre, ce qui nous fait choisir les aponévroses péri-musculaires comme matériel de choix.

Le fragment doit être prélevé en milieu chirurgical, sous anesthésie générale ou locale à distance (poux éviter la présence d'anesthésique dans le fragment).

Le fragment, de quelque 3 à 4 mm de côté, est disposé sur une compresse stérile que le chirurgien referme ensuite et dépose dans une boîte de Pétri contenant 5 à 7 cm3 de sérum physiologique.

La boîte de Pétri, fermée et enveloppée convenablement, peut être conservée ainsi pendant vingt-quatre heures ou mémo quarante-huit, en cas de nécessité. Un tel délai n'est cependant pas souhaitable. De toute façon le transport ne doit pas entraîner de refroidissement notable, le fragment devant être conservé à température ambiante (ni étuve, ni glacière). Le mode de transport importe peu et les longs trajets par avion sont parfaitement possibles.

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B. Mise en culture

Au laboratoire, le fragment est lavé dans du sérum physiologique et divisé avec des bistouris neufs en petits explants de 1 mm de côté environ.

La culture proprement dite est réalisée dans des tubes en pyrex à évidement latéral, dans lequel vient se loger une lamelle couvre-objet (tubes à cultures de tissu du type Institut Pasteur, maison Verrefer). Toute la verrerie doit être en verre pyrex et lavée très soigneusement (éviter les détergents de synthèse), rincée plusieurs fois l'eau distillée et stérilisée à l'autoclave.

Les milieux sont mis en place avec des pipettes Pasteur ne servant qu'une seule fois et les explants sont manipulés avec des pipettes identiques mais à bout recourbé.

La mise en culture proprement dite consiste à étendre sur la lamelle couvre-objet, logée dans son tube, une goutte de plasma de coq *. On dépose ensuite les expiants (deux à trois par lamelle) sur ce film de plasma. A ce moment, l'adjonction d'une goutte d'extrait embryonnaire ** coagule le plasma et fixe les explants sur le verre.

On abandonne alors les tubes, bouchés au caoutchouc gris non toxique, pendant quelques heures, ou au besoin une nuit dans l'étuve à 37°. Après ce laps de temps, on ajoute le milieu de culture. Ce milieu se compose, pour un tube, des éléments suivants :

5 gouttes de sérum humain (de préférence provenant de sujets de groupe AB).

5 gouttes de la solution de Hanks (Institut Pasteur) contenant :

Pénicilline : 200 U. O./cm3

Streptomycine : 50 µg/cm3

Chloramphénicol : 5 µg/cm3

Et 2 gouttes d'extrait embryonnaire.

Après un temps variable, de quatre à six jours, on observe la croissance d'une couronne de fibroblastes autour des explants.

Ceux-ci sont alors enlevés et transférés dans d'autres tubes selon la technique ci-dessus, si l'on désire continuer la culture.

Il est toujours prudent de maintenir simultanément au moins trois tubes par biopsie, ce qui permet d'obtenir des lignées cellulaires parallèles mais indépendantes. Ce dernier fait est important pour pouvoir éliminer à coup sûr la possibilité d'une mutation chromosomique in vitro.

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C. Accumulation des mitoses

L'utilisation de la colchicine et de ses dérivés, proposée par de nombreux auteurs, permet, par blocage des divisions cellulaires, d'obtenir une importante accumulation de cellules en mitoses. Cependant, cette drogue nous semble modifier la résistance mécanique des chromosomes et perturber leur morphologie. De plus, une séparation précoce des centromères ou même une fragmentation des chromosomes à leur niveau viennent compliquer les comptages, et sont probablement la cause des variations du nombre chromosomique rapportées par certains auteurs. Nous n'utilisons donc pas cette substance et employons la technique suivante.

Vingt-quatre à quarante-huit heures après enlèvement de l'explant, une croissance satisfaisante entraîne l'acidification du milieu. Le moment exact du nourrissement est décidé en fonction de l'aspect de la culture et de la coloration de l'indicateur de pH contenu dans la solution de Hanks.

A ce moment, le pH est ajusté par addition de quelques gouttes de solution de Hanks et l'on ajoute deux gouttes d'extrait embryonnaire de poulet.

Après une nouvelle incubation de seize heures, les lamelles sont retirées et l'on observe un très grand nombre de mitoses, les stades les plus fréquents étant des prophases tardives et des pro-métaphases.

Il nous semble que la période d'acidité du milieu permet une synchronisation des divisions cellulaires, que l'extrait embryonnaire vient secondairement stimuler.

Pour éviter toute possibilité de variation chromosomique résultant des conditions anormales de la culture in vitro, seules les toutes premières pousses (moins de quinze jours in vitro) sont analysées. Il est à remarquer cependant que plusieurs lignées cellulaires ont pu être maintenues fort longtemps (six à sept mois) sans entraîner d'anomalie chromosomique décelable. Cependant, par prudence, seules les cultures très récentes sont considérées comme représentant un échantillon fidèle des tissus de l'individu examiné.

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D. Dispersion des chromosomes

A la suite de HSU 1952, de nombreux auteurs ont proposé diverses solutions salines hypotoniques poux réaliser la dispersion des chromosomes. Cependant, l'usage des solutions salines hypotoniques risque de léser la morphologie fine des chromosomes et nous préférons utiliser une solution étendue de sérum humain. Pour ce faire, sitôt retirées du tube de culture, les lamelles sont plongées dans la solution suivante :

Sérum humain : une partie.

Eau pure neutre : cinq parties pendant trente-cinq minutes, la solution étant maintenue à l'étuve à 37°.

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E. Fixation

Une fois retirées de la solution hypotonique, les lamelles sont plongées dans la solution de Carnoy.

Chloroforme : trois parties.

Acide acétique : une partie.

Alcool éthylique absolu : six parties pendait quarante cinq minutes, à température du laboratoire.

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F. Aplatissement des préparations

La facilité de lecture des préparations chromosomiques dépend non seulement de la dispersion des chromosomes, mais aussi de leur situation dans l'espace. Une répartition sur un seul et même plan rend fort aisée l'observation visuelle et constitue une condition sine qua non de la qualité des photographies.

Cette mise de tous les chromosomes sur un même plan peut être réalisée par écrasement progressif mais ferme de la préparation (squash technique). Cette pratique nous semble cependant à déconseiller du fait de ruptures chromosomiques possibles ou même de perte d'un chromosome, chassé au loin. Pour éviter ces dangers de l'écrasement, nous laissons simplement sécher à l'air libre les préparations sortant du Carnoy. Ce séchage de dix à vingt minutes (cellules en dessus) décrit par Rothfels et Siminovitch, 1958, réalise, sans aucune détérioration du matériel chromosomique, une planéité parfaite, sans risque de perte d'éléments.

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G. Coloration

Au lieu de l'orcéine, couramment utilisée par les auteurs anglo-saxons, nous avons mis au point une méthode originale qui permet de colorer très intensément les chromosomes et de différencier l'euchromatine, qui apparaît violet pourpre, de l'hétéro-chromatine (présente dans de petits bras des chromosomes télocentriques), qui apparaît gris bleuté. Par ailleurs, le contraste obtenu entre le fond absolument incolore et le violet pourpre des chromosomes facilite grandement l'observation (en lumière jaune verte de préférence) et la prise de clichés photographiques.

Les étapes de la coloration sont les suivantes :

1) Hydrolyse : Les lamelles sont plongées, cellules en dessus, dans un godet contenant de l'acide chlorhydrique normal, maintenu à 60° C. Sept minutes et demie suffisent pour éliminer toute structure cytoplasmique colorable. Au bout de ce temps les lamelles sont soigneusement rincées à l'eau pure, neutre (eau de source).

2) Coloration au bleu de Unna. Plonger les lamelles (toujours cellules en dessus) dans une solution de :

Un vol. bleu de Urina R. A. L. (solution du commerce) Maison Prolabo.

Quatre vol. eau neutre pendant dix minutes.

3) Retirer et rincer très légèrement à l'eau neutre pour éliminer l'excès de colorant.

4) Laisser sécher à l'air libre jusqu'à dessiccation complète (cinq à dix minutes). Ce dernier temps permet d'éviter le passage classique dans l'alcool éthylique, qui risque d'enlever une partie du colorant fixé sur les chromosomes.

On monte ensuite la préparation sur lame, cellules entre lame et lamelle, dans du baume du Canada après passage dans le toluène pour éviter les bulles l'air.

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H. Observations

Les meilleures mitoses, c'est-à -dire les plus lisibles, sont alors sélectionnées au faible grossissement (obj. x 8) puis photographiées sur microfilm Kodak 24 X 36 Panchromatique (obj. immersion 100, grossissement effectif sur le film de 400 environ).

Les négatifs sont ensuite agrandis d'un facteur x 8 pour donner un agrandissement terminal sur le positif de 3 000 environ. Tous les comptages et surtout toutes les études caryotypiques sont effectués sur ces photographies.

Il faut en effet rappeler que l'observation visuelle, même patiente et avertie, ne permet pas d'identifier avec certitude certaines paires chromosomiques. Les montages caryotypiques [cf. Lejeune, Turpin, Gautier, 1959 (2)] doivent donc être considérés comme faisant partie intégrante de l'examen des chromosomes.


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Bibliographie

1. LEJEUNE (J.), GAUTIER (M.) et TURPIN (R.). Les chromosomes humains en culture de tissus (C. R. Acad. Sciences, 1959, 248, 602).

2. LEJEUNE (J.), TURPIN. (R.) et GAUTIER (M.). Le mongolisme, premier exemple d'aliénation autosomique humaine (Annales de génétique, 1959, 2, 41).

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Notes

(*) Ce plasma de coq est obtenu par ponction de la veine marginale de l'aile, et aspiration du sang dans une seringue contenant 1 cm3 d'héparine. Le sang est immédiatement centrifugé à trois mille tours/minute pendant dix secondes et le plasma est conservé à la glacière en tube stérile hermétiquement clos.

(**) L'extrait embryonnaire, obtenu à partir d'oeufs incubés neuf à dix jours, est en réalité le surnageant du broyat, dilué avec la solution de Hanks en proportion 1 : 1.