Sur les anomalies chromosomiques rencontrées au cours de certaines leucémies aiguës myeloblastiques

MM. J. RUFFIE, J. LEJEUNE, Melle A.M. MOURLAN

Congrès d'Hématologie, Mexico, septembre 1962

• 1 - Les leucémies myeloïdes chroniques


• 2 - Les leucémies myéloblastiques aiguës


• Technique


• Résultats
• CAS N° 1 :
• CAS N° 2 :
• CAS N° 3 :


• Conclusion




• Annexes

C'est en 1960 que HUNGERFORD et collaborateurs décrivent une nouvelle culture des cellules du sang circulant (11).

Cette méthode est capable de donner d'excellentes figures de chromosomes et peut servir à une bonne analyse des caryotypes des cellules sanguines.

Plusieurs auteurs entreprirent aussitôt d'analyser le stock chromosomique des cellules nucléées du sang chez les malades porteurs de diverses hémopathies.

Les premiers résultats furent assez difficiles à interpréter. Par la suite et grâce sans doute aux progrès de la méthode y il apparut que certaines hémopathies s 'accompagnaient assez souvent d'anomalies chromosomiques singulières. C'est ainsi que chez ces malades, on trouvait parfois côte à côte, deux clones de cellules sanguines, l'un à caryotype normale l'autre à caryotype porteur d'une aber-ration caractéristique. Parmi les hémopathies ainsi étudiées, il faut citer la macroglobulinémie de Waldenstrom où BOTTURA et coll. (3), GERMAN et coll. (7), BERNISCHKE et coll. (2) décrivent un grand chromosome surnuméraire. En ce qui concerne les leucoses la question est plus complexe. Les leucoses portant sur la série lymphoïde ont donné lieu à divers travaux : FORD (5), NOWELL & HUNGERFORD (14), HUNGERFORD (9), WAHRMAN, SCHAAP & ROBINSON (18), DE GROUCHY & LAMY (8), LEJEUNE (11), au cours desquels il semble bien que l'on ait noté parfois la présence de clones cellulaires présentant des aberrations constantes.

Toutefois le nombre de cas étudiés est encore insuffisant pour pouvoir rattacher en toute certitude ces diverses aberrations chromosomiques à un type cytologique de leucose bien individualisé.

Nos connaissances sont plus avancées en ce qui concerne les leucoses portant sur la lignée rnyéloïde. On peut les résumer ainsi :

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1 - Les leucémies myeloïdes chroniques

Dans la majorité des cas ces leucoses révèlent l'existence d'un clone porteur d'un très petit chromosome acrocentrique. Appelé Ph1, en souvenir de la ville de Philadelphie dans laquelle il fut découvert par NOWELL et HUNGER-FORD, 1960 (13) ce chromosome semble être un 21, dont les grands bras auraient été amputés de la moitié de leur longueur.

Dans une revue générale de la littérature, incluant leurs observations personnelles, TOUGH, COURT BROWN et coll., 1962, rapportent que sur 22 cas étudiés avant tout traitement, 21 présentaient le clone mutant Ph1. Par ailleurs, ces auteurs observant 5 malades avant et après radiothérapie splénique, montrent que l'importance du clone Ph1 dans le gang périphérique diminue en fonc tion du traitement. Lorsque la leucocytose tombe au dessous de 20 000 G B mm3 le clone disparaît entièrement du sang circulaire alors qu'il persiste y prépondérante dans la moelle osseuse.

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2 - Les leucémies myéloblastiques aiguës

Elles ont fait, elles aussi l'objet de divers travaux. FORTUNE, LEWIS & POULDING (6) rapportèrent en 1962 le cas d'une leucose myéloblastique chez l'enfant qui présentait un clone porteur d'un Ph1 spécialement petit.

En 1961, HUNGEEFORD avait de son côté décrit un cas de leucémie myéloblastique aiguë dans laquelle 10 % des mitoses étaient à 45 chromosomes. Malheureusement il ne signale pas quel est le chromosome manquant (9).

En 1962, RUFFIE & LEJEUNE (16) étudièrent les caryotypes sanguins de deux malades porteurs de leucoses aiguës myéloblastiques qui se caractérisaient par des clones cellulaires à 45 chromosomes par suite de la perte totale d'un petit acrocentrique.

Depuis nous avons poursuivi nos recherches dans ce sens. C'est le résultat actuel de nos travaux que nous exposons ici.

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Technique

Nous avons essayé de cultiver 17 leucoses qui se présentaient cliniquement et histologiquement comme des leucoses aiguës de la lignée granulocytaire. L'envahissement cellulaire portait toujours sur des stades jeunes. Le plus souvent paramyéloblastes et promyélocytes accompagnés parfois de quelques hémocytoblastes. Comme on pouvait s'y attendre, les malades chez qui les promyélocytes dominaient ont présenté une évolution un peu moins rapide que les autres.

Sur 17 sangs de leucose myéloblastique cultivés, 10 ont poussé et donné des caryotypes analysables. Sur ce nombre 7 n'ont révélé que des cellu-les à stock chromosomique normal. (TABLEAU 1).

Toutefois il est intéressant de noter que ces dernières leucoses étaient sous traitement depuis déjà un certain temps. De plus dans plusieurs cas le nombre de cellules analysables était trop faible pour que l'on puisse en tirer des conclusions.

Par contre 3 leucoses ont présenté une double population cellulai-re : population normale et population à 45 chromosomes par perte d'un petit acrocentrique. Il faut souligner que dans ces 3 cas, le premier examen des caryotypes sanguins a été effectué soit avant tout traitement soit chez des malades traités depuis peu de temps. Par suite, d'autres cultures ont été pratiquées tout au long de l'évolution de la maladie.

La technique suivie fut celle de NOWELL & HUNGERFORD (12) que nous avons modifiée sur quelques points de détails.

Rappelons que dans cette technique le sang est prélevé par ponction intraveineuse sur flacon héparine. Les globules rouges et les granulocytes âgés sont éliminés par adjonction au milieu de phytoagglutinine et centrifugation lente après incubation au réfrigérateur. La mise en culture se fait dans le milieu 199 dont la quantité ajoutée doit être telle que la concentration cellulaire du milieu soit de 1000 à 2000 éléments au mm3.

Il importe d'avoir plusieurs tubes de culture par malade afin d'effectuer l'étude des caryotypes après 24, 48 et 72 heures d'incubation. Au moment choisi, les mitoses sont bloquées et accumulées par la colchicine. On effectue ensuite l'éclatement des noyaux en mitose par choc hypotonique (citrate de soude à 0,95 %). La préparation est fixée par un mélange acide acétique glacial + alcool absolu. On l'étale sur lames refroidies, en hydrolyse les frottis par l'HCl normal, on lave, on colore au Giemsa et on cherche les meilleures préparations qui seront photographiées et serviront au classement des chromosomes.

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Résultats

Nous avons pu étudier ainsi 3 malades qui présentaient tous à côté des cellules à caryotype normal, un clone cellulaire à 45 chromosomes par suite de l'absence d'un petit acrocentrique. Etant donnée la ressemblance qui existe entre des petits chromosomes de ce type et la difficulté où l'on est d'identifier un élément manquante il est difficile de savoir avec certitude si le chromosome absent appartient à la paire 21 ou 22. Toutefois il paraît assez vraisemblable qu'il s'agisse bien du type 21.

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CAS N° 1 :

Z. TH..., 14 ans, présente une leucémie aiguë à prédominance de paramyéloblastes. La malade entre en clinique le 28/11/61. Traitement à base de corticoïdes et d'antibiotiques. Décès le 27/12/61. Pendant la brève durée de la maladie, nous avons effectué 3 cultures de cellules du sang qui ont donné les résultats rapportés au tableau 2.

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CAS N° 2 :

HO..., homme de 62 ans y ayant présenté depuis août 1961 un épisode fébrile inexpliqué. Transporté à TOULOUSE le 10/8/61 pour syndrome d'anémie et d'agranulocytose, l'examen médullaire nous fait porter le diagnostic de leucémie aiguë à hémocytoblastes et myéloblastes. Traité par corticothérapie et antibiotiques. Après une amélioration passagère, le malade meurt le 30/5/62. L'étude des caryotypes est rapportée au tableau 2.

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CAS N° 3 :

P. PR..., 8 ans, leucose aiguë à prédominance de promyélocytes. On trouve aussi des myéloblastes atypiques. Traitement à la cortisone puis au méthotrexate. Le résultat des cultures est donné au tableau 2.

Une culture faite sur un prélèvement cutané nous a montré que les fibroblastes avaient tous un caryotype normal.

A l'heure actuelle, le petit malade est toujours en vie, bien que son état se soit encore aggravé au cours des derniers mois.

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Conclusion

II n'est guère possible de tirer des conclusions définitives d'une étude cytogénétique portant seulement sur trois cas de leucémie aiguë de la lignée myéloïde. Toutefois l'analyse de ces trois cas permet les remarques suivantes qui pourront servir de base à des travaux ultérieurs :

1 - Certaines leucémies aiguës portant sur la lignée granulocytaire semblent se caractériser par l'existence à côté de cellules à caryotype normal, de clones cellulaires à 45 chromosomes par suite de la perte d'un petit acrocentrique (élément 21 ou 22, mais vraisemblablement 21).

Comme nous l'avons déjà signalé à une autre occasion (16), ce phénomène est à rapprocher de la présence du chromosome Ph1 trouvé par certains auteurs dans les cellules des leucémies myéloïdes chroniques. Ces deux constatations jointes au fait que la leucémie aiguë est 20 fois plus fréquente chez les enfants mongoliens que chez les enfants non mongoliens du même âge posent le problème du rôle du chromosome 21 dans la granulopoïèse.

2 - L'examen du Tableau 2 paraît montrer que le pourcentage des cellules anormales rencontrées sur les préparations de culture diminue rapidement chez le malade traité. C'est donc en début de maladie, chez le sujet n'ayant encore fait l'objet d'aucune thérapeutique, que l'on a le maximum de chances de rencontrer les deux clones cellulaires. Par la suite, le clone anormal tend à disparaître (ou tout au moins à ne plus pousser). Il semble rester très rare ou même absent des préparations jusqu'à la phase terminale de la maladie.

Nous avons sur le diagramme suivant visualisé les fréquences relatives des cellules haplo-21 par rapport à l'ensemble des cellules étudiées au cours de chaque culture bloquée à la 72e heure. Nous n'avons évidemment pas tenu compte des cultures qui n'ont pas poussé.

Dans tous les cas les droites obtenues ont la même allure. II nous a paru intéressant de comparer statistiquement ces baisses de pourcentages.

Dans le cas n°1 (TH...) nous avons utilisé le calcul direct. Il démontre que la probabilité (P 1) d'obtenir par le hasard seul une baisse de pourcentage égale ou inférieure à celle observée, correspond à P 1 = 0,16.

Pour le cas n°2 (HO...), nous avons calculé le ?2, selon la méthode de V.M. DANDEKOR (17) qui donne ?2 = 0,9418, correspondant à P 2 = 0,31.

Pour le cas n°3 (PR...) le ?2corrigé de Yates donne une valeur de 43,02 et P 3 inférieur à 0,001 ce qui correspond à moins de une chance sur mille pour que les variations de pourcentages observées soient dues au hasard.

Ceci donne à penser qu'il est hautement probable que les variations des fréquences des cellules anormales observées dans nos trois cas, et qui affectent toujours la même allure, ne sont pas dues au hasard mais correspondent à un phénomène systématisé.

Cette disparition progressive du clone haplo-21 (dans le sang circulant tout au moins, car la moelle de ces malades n'a pu être étudiée), présente un parallélisme frappant avec la disparition du clone Ph1 signalé par TOUGH, COURT BROWN et coll.,1962.

3 - Enfin l'étude du cas n°3 pourrait donner à penser que les cel-lules anormales (haplo-21) poussent plus vite que les cellules normales, certaines cultures étant porteuses des deux clones uniquement dans le blocage à la 24e heure, alors que les blocages suivants ne révèlent que des caryotypes normaux. Toutefois, il s'agit là d'une simple indication non pas d'une certitude, le nombre de cellules étudiées étant trop faible pour être absolument démonstratif.

Un tel phénomène a été signalé par NOWELL & HUNGERFORD (14) pour les clones porteurs du chromosome Ph 1 des leucémies myéloldes chroniques. Ces cellules ont paru se diviser plus tôt in vitro que les cellules normales. Pour ces auteurs, c'est au bout de 48 heures d'incubation que le pourcentage de caryotypes porteurs de Ph 1 est maximum, il décroît ensuite fortement à partir de la 72 e heure. Donc un blocage de mitose trop retardé peut faire croire qu'il existe uniquement des cellules à caryotype normal. Ce phénomène pourrait peut-être expliquer les cas de leucoses aiguës myéloblastiques où la culture nous a révélé uniquement des cellules à caryotype normal. A ce moment, toutes nos fixations ont été faites à la 72e heure.

C'est en tenant compte de ces divers éléments que l'expérimentation doit désormais se poursuivre.

Fig. 1. - Diagramme figurant les variations de fréquences relatives des cellules haplo-21 ou 22 par rapport à l'ensemble des cellules analysées au coursdes différentes cultures pratiquées durant l'évolution des leucoses muéloblastiques que nous avons étudiées.

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Bibliographie

1 - BAIKIE A.G., COURT BROWN W.M., BUCKTON K.E., HARNDEN D.G., JACOBS P.A., TOUGH I.M. ; A possible specific chromosome abnormality in human chronic myeloid leukaemia Nature 188, 1960, 1165.

2 - BENIRSCHKE K., BROWNHILL L..EBAUGH F.G. : Chromosomal abnormalities in Waldenstrom's macroglobulinaemia Lancet 1, 1962, 594.

3 - BOTTURA C., FERRARI I., VEIGA A.A. : Chromosome abnormalities in Waldenstrom's macroglobulinaernia Lancet i, 1961, 1170.

4 - FORD C.E. , NOLE R.H. : Chromosome studies in human leukaemia Lancet ii, 1959, 732.

5 - FORTUNE D.W., LEWIS F.J.W., POULDING R.H. : Chromosome pattem in myeloid leu-kaemia in a child Lancet i, 1962, 537.

6 - GERMAN J. L., BIRO C.E., BEARN A.G. : Chromosomal abnormalities in Waldenstrom's macroglobulinaemia Lancet ii, 1961, 48.

7 - DE GROUCHY J., LAMY M. : Communication personnelle.

8 - HUNGERFORD D. A. : Chromosome studies in human leukaemia J. Net. cancer Inst. 27, 1961, 983.

9 - J. LEJEUNE : Les anomalies chromosomiques dans les hémopathies Communication IVe Congrès National T. S. Toulouse Juin 1962.

10 - J. LEJEUNE : Communication personnelle.

11 - MOORHEAD P.S., NOVELL P.C,, MELLMAN W.J., BATTIPS D.M., HUNGERFORD D.A. : Chromosome préparations of leukocytes cultured from human peripheral blood Exp. Cell. Res. 1960, 613.

12 - NOWELL P. C., HUNGERFORD D.A., BROOKS C.D. : Chromosomal characteristics of nor-mal and leukemic human leukocytes after short term tissue culture. Proc. Amer, Ass. Cancer Res. 1958, 331.

13 - NOWELL P.C., HUNGERFORD D.A. : Aetiology of leukaemia Lancet i, 1960, 113.

14 - NOWELL P.C., HUNGERFORD D.A. : A minute chromosome in human chronic granulocytic leukaemia Science 132. 1960, 1497.

15 - J. RUFFIE : Les techniques d'étude des chromosomes dans les cellules du sang circulant, Toulouse-Médicale 1962, 207.

16 - RUFFIE J., LEJEUNE J. : Deux cas de leucose aiguë myéloblastique avec cellules sanguines normales et cellules haplo (21 ou 22) Rev. Franc. Et. Clin. Biol. 7, 1962.

17 - RAO : Advanced statistical methods in biometric research J. Widey and Sous P. 203.

18 - WAHRMAN J., SCHAAP T., ROBINSON E. : Manifold chromosome abnormalities in leu-kaemia Lancet i, 1962, 1099.