Banque de cellules diploïdes humaines à caryotypes anormaux.
Sophie CARPENTIER et J. LEJEUNE.
Extrait des Annales de Génétique 1970, volume 13, n° 2, pp. 135-140.
Sommaire
Introduction
Le caractère généralement rare, quelquefois unique, de certaines anomalies chromosomiques rend regrettable l'impossibilité où l'on se trouve habituellement de conserver les prélèvements dont on dispose pour l'étude caryotypique.
La conservation de ces prélèvements présenterait, en effet, de nombreux avantages. Par exemple, la possibilité d'études comparatives d'anomalies caryotypiques telles les délétions ou les translocations, permettant d'établir une carte génique humaine ; par exemple encore, la possibilité d'études morphologiques, physiques ou biochimiques lors de l'apparition de techniques nouvelles qui nécessiteront d'avoir dans les meilleurs délais un matériel génétique toujours disponible, quelle que soit la rareté de l'anomalie.
La constitution d'une banque de cellules diploïdes humaines à caryotypes anormaux nous a paru susceptible de répondre à ces préoccupations. Utilisant les méthodes de congélation tissulaire, il est possible, en effet, de préserver toutes les souches cellulaires ou les prélèvements que l'on désire.
A la condition d'être très largement ouverte à tous les laboratoires, cette banque est à même de réunir en quelques années un matériel continuellement disponible, couvrant toutes les anomalies connues, aussi rares qu'elles puissent être.
Matériels et méthodes
Tissus
Les fragments de tissus destinés à la congélation proviennent de malades ayant déjà subi un examen caryotypique révélant une anomalie chromosomique constitutionnelle. Ce premier dépistage est fait sur une culture de sang selon une micro-méthode précédemment décrite [7].
Les prélèvements de tissus sont faits, soit en laboratoire (prélèvements de peau), soit en milieu chirurgical soit post-mortem (prélèvements d'aponévrose ou de gonades).
Les prélèvements proviennent, pour la plupart, de notre laboratoire à l'Hôpital des Enfants-Malades. D'autres nous sont expédiés par divers laboratoires, dont ceux participant à la Recherche Coopérative sur Programme du CNRS n° 85.
Technique de prélèvement
ne région de peau glabre - face interne de l'avant-bras, ou omoplate - est lavée très soigneusement au savon, puis rincée à l'eau distillée stérile, on pratique ensuite un nettoyage à l'alcool avec une compresse stérile, puis à l'éther. Après évaporation de l'éther, la peau est prise entre les mors d'une pince type " clamp intestinal " en laissant apparaître au bord supérieure de la pince un pli d'environ 1,5 cm de longueur sur 2 mm de hauteur. Ce repli est recouvert d'une compresse imbibée d'éther. Quelques minutes suffisent pour que la peau devienne blanche et insensible. Après évaporation de l'éther, le prélèvement est fait en sectionnant au bistouri la partie centrale du repli cutané délimité par la pince. On obtient ainsi un fragment de 3-4 mm de longueur sur 1 mm d'épaisseur en son centre.
En attendant leur mise en culture, les fragments doivent être placés , +4 °C soit dans une solution de ClNa à 9 % contenant 40 µg/ml de kanamycine et 50 ug/ml de solnicol, soit dans une solution de Hanks, Earle ou P.B.S. contenant les mêmes concentrations d'antibiotiques, ou mieux encore dans un milieu de Eagle à 10 % de sérum de veau (milieu de croissance) (*) :
| Basal Medium Eagle (Diploid) | 9,3 gr |
| Eau bidistillée | 880 ml |
| NaHCo 3 à 5,6 % | 1 ml |
| Kanamycine | 40 mg |
| Solnicol | 50 mg |
| Sérum de veau | 100 ml |
| 1000 ml |
Le sérum de veau (**) utilisé a été préalablement inactivé 30 minutes à 56 °C et conservé à -20 °C.
La quantité de bicarbonates a été calculée de façon à obtenir un milieu de pH 7,4.
Le milieu est filtré par pression sur filtres Millipore type GS (diamètre des pores 0,22 µ), réparti en flacons pyrex de 100 cc, et stocké à + 4 °C.
Mise en culture et entretien (fig. 1 )
La mise en culture est faite le plus tôt possible. Les prélèvements de tissus découpés en fragments de 1 mm de côté sont rincés dans une solution de Hanks (ou P.B.S. au Earle) contenant des antibiotiques à la concentration indiquée plus haut.
Ils sont ensuite déposés sur une lamelle 10 X 50 avec une goutte de plasma de coq mélangée à une goutte d'extrait embryonnaire dilué à 50 %. Après la prise du coagulum, la lamelle est introduite dans un tube de Leighton puis recouverte de 2 cc du milieu de croissance décrit plus haut. La phase gazeuse des tubes est équilibrée par un mélange d'air et de CO2 (95/5).
Les tubes sont gardés à l'étuve à 37° ± 0,5.
Le milieu est renouvelé 2 fois par semaine.
Les premières cellules apparaissent après 3 à 7 jours de culture. La croissance est souvent de type épithélial au début, puis devient très vite essentiellement fibroplastique en formant de larges couronnes autour des explants.
Lorsque les cellules deviennent confluentes (4e semaine environ), elles sont soumises à une trypsination selon la technique de Hayflick [4] qui utilise une solution de Trypsine (***) 0,25 % dans une solution de Earle (pH final 7,5). Après dissociation par ce traitement, les cellules sont transférées dans un flacon de 60 cc en polystyrène ou en verre, contenant 4 cc de milieu de croissance avec des antibiotiques. L'atmosphère des flacons est équilibrée à 5 % de CO2 comme précédemment.
Les expiants, non dissociés par ce bref traitement de trypsine, peuvent être remis en culture.
Lorsque le flacon, de 60 cc est totalement envahi de cellules, on effectue une 2e trypsination pour transférer les cellules dans un flacon de 250 cc. Ce type de flacon représente une unité pratique pour la congélation (il contient environ 1 à 2 M de cellules).
Fig. 1. 1)
Congélation de fragments de tissus avant culture. 2) Congélation d'une
suspension cellulaire après culture. 3) Congélation de fragments de tissus
après culture.
Notes
(*) Milieu Eagle BME (Diploid) en poudre, avec sels. de Earle, avec L-Glutamine, et sans bicarbonates. Refer. G. 13. GIBCO - Grand Island Biological Company, 3175 Staley Rd, grand Island NY 14072 USA.
(**) Institut Merieux, 69-Marcy-l'Etoile, France.
(***) Trypsine DIFCO 1/250.