Cytogénétique humaine. - Sur une nouvelle technique d'analyse du caryotype humain.

MM. Bernard Dutrillaux et Jérôme Lejeune, présentée par M. Raymond Turpin.

C. R. Acad. Sc. Paris, t. 272, p. 2638-2640 (17 mai 1971) Série D.


Résumé :

Les préparations sont plongées pendant 10 mn dans un tampon phosphate pH 6,5, maintenu à 87°. Une coloration simple (Giemsa) met alors en évidence une structure pseudo-moniliforme des chromosomes humains, permettant de les reconnaître individuellement.

Sommaire

Depuis la découverte de Casperson et coll. (1) il est établi que les chromosomes humains possèdent une structure interne reconnaissable après coloration par des dérivés de la quinacrine et observation de la fluorescence en lumière ultraviolette.

Récemment Yunis et coll. (2) ont obtenu une coloration paradoxale du centromère au cours d'essais de dénaturation de l'ADN chromosomique par chauffage à 90° et renaturation à 65°.

Après avoir utilisé la méthode décrite par ces auteurs, nous avons noté l'apparition de structures pseudo-moniliformes dans certaines cellules lors de variations contrôlées des conditions expérimentales.

De nombreux essais ont permis de préciser une méthode simple permettant de reproduire ce résultat.

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Technique

Les étalements de cultures de sang périphérique sont réalisés par notre technique habituelle (3), la fixation étant faite au Carnoy chloroformé pendant 35 mn suivie d'une fixation au mélange de Carnoy acétique pendant 20 mn. Le milieu utilisé pour le choc hypotonique est celui précédemment décrit (3).

Après séchage à l'air libre, les lames sont plongées pendant 10 à 12 mn dans un bain de tampon phosphate pH 6,5 de molarité (20 mM) maintenu à la température de 87°C. On laisse ensuite refroidir spontanément jusqu'à 70°. Les lames sont ensuite rincées et plongées dans le colorant de Giemsa dilué dans ce même tampon, à température ambiante. Après 10 mn, une coloration un peu pâle des chromosomes est observée et la reconnaissance de la structure fine de chaque paire requiert l'usage du contraste de phase.

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Résultats

Des zones colorées, séparées par des zones claires, siègent en des points identiques des deux chromatides de chaque élément, exactement aux endroits " non fluorescents " décrits par Casperson, exception faite de la constriction secondaire du 9. La constance de ces structures permet de définir sans ambiguïté chaque paire chromosomique (fig.).

Ainsi que le démontre l'analyse de cellules trisomiques 21, le bras long du 21 possède une zone claire juxtacentrique (zone fluorescente de Casperson) et une zone télomérique fortement colorée. Cette structure très reconnaissable reste aisément décelable sur une translocation 21-21, On note que le bras long du 22 est intensément coloré sur toute sa longueur (faible fluorescence notée par Casperson).

Enfin, même dans des translocations entre chromosomes moyens, le diagnostic des éléments donneurs et receveurs ainsi que celui du segment échangé reste très aisé comme dans un cas (11p- ; 10q+).

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Conclusions

La simplicité et la fidélité de cette méthode, ne nécessitant aucun équipement particulier, nous font considérer qu'elle accroîtra considérablement l'efficacité des examens cytogénétiques en permettant l'identification précise de chacun des éléments normaux et anormaux.


fig.


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Bibliographie

(1) T. CASPERSON, L. ZECH et C. JOHANSSON, Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents, Exptl Cell Res., 62,1970, p. 490-492.

(2) J. J. YUNIS, L. ROLDAN et W. G. YASMINEH, Staining of repetitive DNA in metaphase chromosomes (Communication personnelle).

(3) R. TURPIN et J. LEJEUNE, Les chromosomes humains, Gauthier-Villars,1965, p. 23-29,1 volume.