Effet du milieu ionique sur la dénaturation thermique ménagée des chromosomes humains
Sophie CARPENTIER, B. DUTRILLAUX et J. LEJEUNE.
CARPENTIER Sophie, DUTRILLAUX B., LEJEUNE J. - Effet du milieu ionique sur la dénaturation thermique ménagée des chromosomes humains. Ann. Génét., 1972, 15, n° 3, 203-205.
Résumé :
Un protocole précis de la méthode de dénaturation thermique ménagée est présenté. Tout spécialement l'usage d'une solution ionique équilibrée, isotonique, permet d'améliorer considérablement la fiabilité de la technique et de l'appliquer aussi aisément aux cultures de sang périphérique qu'aux cultures de fibroblastes.Sommaire
La mise en evidence de la structure fine des chromatides par dénaturation thermique ménagée [Dutrillaux et Lejeune, 1971] est devenue d'application courante en cytogénétique.
Cependant une certaine irrégularité des résultats, joints à la difficulté d'application de la méthode à des cultures de fibroblastes nous ont conduit à modifier progressivement le protocole initial.
De multiples essais il ressort que les modifications du pH, de la temperature et du temps d'action ont toutes un certain effet mais n'augmentent pas sensiblement la fiabilité de la méthode.
Par contre la qualité ionique de la solution dans laquelle les lames sont plongées joue un rôle considérable. Des essais systématiques avec des solutions mono-ioniques isotoniques ont montré qua la nature des ions influait considérablement sur la qualité de l'image obtenue. Ainsi toutes choses égales par ailleurs, des solutions isotoniques de NaCl, de MgCl2 ou de KCl ont des conséquences tout à fait différentes sur le marquage des chromatides.
Bien que ces investigations systématiques soient loin d'être terminées, elles nous permettent d'aboutir dès maintenance à une légère modification de la technique initiale et à remplacer le tampon phosphate précédemment utilisé, par une solution ionique, équilibrée, isotonique. La solution classique de Earle est tout à fait satisfaisante. Les autres solutions classiques P.B.S., Hanks, etc., peuvent aussi titre utilisées.
Tout particulièrement, la dénaturation thermique ménagée selon le protocole suivant permet d'obtenir des images fines et contrastées aussi bien sur des étalements provenant de cultures de sang périphérique que sur des lames provenant de cultures de fibroblastes (fig. 1).
Fig. 1.
- Caryotype masculin normal.
Protocole
A - Préparation des cellules
Pour les cultures de sang périphérique, on emploie la technique habituelle avec incubation de 72 h. [2].
Pour les cultures de fibroblastes, on établit une couche monocellulaire en flacon Falcon, puis 36 à 48h après une trypsination on traite la culture à la colchicine (0,04 mg‰) pendant 2 heures.
Les cellules sont ensuite décollées par action de la Trypsine à 37° (Trypsine Difco 1/250 à 0,2 %( dans du liquide de Earle), et soumises pendant 30 mn à un choc hypotonique à 37° dans le milieu suivant :
Eau bidistillée : 50 ml
Sérum de poulain : 10 ml
Solution de chlorure de Magnesium (*) : 0,7 ml
Hyaluronidase : 3 ml
B - Fixation et étalement
Après centrifugation et élimination du milieu hypotonique, une première fixation est réalisés avec le mélange de Carnoy :
Ethanol absolu : 6 vol
Chloroforme : 3 vol
Acide acétique : 1 vol
pendant 25 mn.
Après centrifugation et élimination du fixateur, le culot cellulaire est repris dans le fixateur :
Ethanol : 3 vol
Acide acetique : 1 vol pendant 10 mn, puis centrifugé 5 mn.
L'étalement est ensuite réalisé sur des lames recouvertes d'un mince film d'eau bidistillée a température de la glace fondante (**).
Le temps écoulé entre l'étalement et la dénaturation semble joué un rôle important. Il semble influencer la qualité du marquage. Ainsi selon les séries d'examens, un délai de quelques heure peut suffire pour obtenir un beau résultat, alors que parfois, plusieurs jours, voire plusieurs semaines sont nécessaires.
Lorsque ce délai est trop court, les chromosomes prennent, après leur dénaturation, un aspect " pelucheux ", reconnaissable, et il est aisé de remédier à cet inconvénient en traitant d'autres lames provenant du même examen plusieurs jours après.
C - Dénaturation thermique ménagée
1. Plonger les lames dans une solution ionique équilibrée (liquide de Earle par exemple à pH 6,5) pendant 10 à 20 mn. Ce liquide est maintenu a 87 °C dans un bain-marie très précis.
Si après un tel traitement de 10 a 20 mn l'aspect des chromosomes n'est pas suffisamment modifié ou pas encore modifié, il est nécessaire de prolonger le temps de dénaturation éventuellement pendant plusieurs heures, pour les autres lames du même malade. Ces conditions particulières peuvent provenir d'un délai trop long entre le moment de étalement et celui du traitement thermique.
2. Les lames sont alors immédiatement rincées A l'eau courante pendant 5 mn et plongées 10 mn dans la solution suivante maintenue à la température ordinaire :
Solution de Giemsa R : 4 ml
Tampon phosphate à pH 6,7 (***) : 4 ml
Eau bidistillée : 92 ml
On rinces ensuite les lames quelques secondes à l'eau courante. Après sèchage à l'air libre, elles sont ensuite observées au microscope.
Conclusions
Ces modifications légères du protocole initial accroissent considérablement la fiabilité de la méthode et permettent d'utiliser l'analyse fine des chromatides comme méthode de routine pour tous les examens cytogénétiques.
On notera que pour les très belles préparations l'analyse au microscope peut être realisée en lumière directe. Cependant, pour la photographie, indispensable à l'analyse caryotypique précise, l'usage du contraste de phase reste indispensable.
Les modifications chimiques subies par les chromatides au cours de ces traitements sont encore inconnues. Il nous paraît cependant que l'effet indiscutable de la qualité des ions présents dans ce milieu devrait permettre une approche précise des phénomènes physico-chimiques impliqués par la methode de dénaturation thermique ménagée.
Bibliographie
1. DUTRILLAUX B., LEJEUNE J., 1971 - Sur une nouvelle technique d'analyse du caryotype humain. C.R. Acad. Sci. (Paris), 272, 2638.
2. TURPIN R., LEJEUNE J., 1965, - Les chromosomes humains Gauthier Villars éd., Paris.
Notes
(*) Formule : Mg Cl2, 6H20: 20,33 g, eau distillée : 1000 ml.
(**) Il nous paraît important que les lames aient été préalablement plongées quelques jours dans l'acide sulfochromique puis lavées au savon et soigneusement rincées à l'eau bidistillée.
(***) Formule du tampon phosphate: KH2PO4 : 7,39g ; eau bidistillée q.s.p. 1000 ml. Le pH de ce tampon est ajusté à 6,7 par addition de Na2HPO4, 12 H2O.