Différenciation des chromosomes X par les méthodes de déspiralisation au 5 bromodeoxyuridine (BUDR) et de dénaturation thermique ménagée
L.T. BARANOVSKAYA1, A.F. ZAKHAROV1, B. DUTRILLAUX2, S. CARPENTIER2, M. PRIEUR2, J. LEJEUNE2.
BARANOVSKAYA L.T. (*), ZARHAROV A.F., DUTRILLAUX B., CARPENTIER S., PRIEUR M., LEJEUNE J. (1972). - Différenciation des chromosomes X par les méthodes de despiralisation au 5-bromodéoxyuridïne (BUDR) et de dénaturation thermique ménagée. Ann. Génét., 1972, 15, n°4, 271-274. (*) Institute of Medical Genetics, AMS USSR Kashirskoye Skosse 6a, 11 5478 Moscow (USSR).
Résumé :
Le marquage de chromosomes X normaux ou anormaux est étudié dans des cellules à 46,XX, 48,XXXX et 46,Xi(Xq). Après traitement par le BUDR on peut distinguer les X à replication tardive des X à replication précoce.Cette distinction semble impossible après dénaturation ménagée.Sommaire
Avec les nouvelles techniques de marquage chromosomique, il est devenu aisé d'identifier tous les chromosomes humains.
En particulier, la reconnaissance des chromosomes X naguère confondus avec les autres éléments du groupe C, apporte de précieux renseignements. Il nous a paru intéressant de comparer les résultats obtenus dans l'analyse de caryotypes féminins normaux, et anormaux à 45,X/46,X i(Xq) et à 48,XXXX, par deux méthodes de marquage aux principes différents.
L'une est une méthode dynamique, faisant intervenir un agent modifiant la spiralisation des chromosomes de cellules vivantes [7, 8], l'autre agit sur les préparations fixées, par dénaturation ménagée [3].
Technique
Des cellules de la patiente atteinte du syndrome de Turner à 45,X/46,X i(Xq), et de la patiente à 48,XXXX, et de différentes patientes normales sont analysées par chaque méthode, après culture de cellules sanguines. De plus, des cellules fibroblastiques de la patiente à 48,XXXX, sont examinées après décongélation d'une suspension cellulaire préservée dans l'azote liquide [2].
Méthode au BUDR
Le BUDR (5-bromodéoxyuridine, calbiochem U.S.A.) est ajouté après 72 heures de culture, à la concentration finale de 200 mg/ml de milieu, et laissé au contact des cellules pendant 5 à 6 heures.
L'adjonction de colchicine, à la concentration de 0,2 mg/ml pendant les 90 dernières minutes d'incubation avec le BUDR, permet une accumulation des mitoses. Après un choc hypotonique de 5 minutes, dans une solution aqueuse de KCL à 0,075 M, les cellules sont fixées par un mélange de méthanol et d'acide acétique, dans les proportions 3 : 1.
Les préparations sont séchées à l'air, et colorées par un mélange d'azur-éosine.
Méthode de dénaturation
Pour les cellules sanguines, la technique utilisée fut celle préalablement publiée [4], Une modification fut apportée pour l'analyse des fibroblastes de la patiente à 48,XXXX [3].
Résultat
1) Technique au BUDR.
Plusieurs dizaines de cellules, avec une bonne segmentation des X, furent examinées pour chaque patient, bien que la réaction au traitement fut en règle assez pauvre.
Cas à 48,XXXX.
Un total de 30 métaphases, avec une différenciation correcte des X fut étudié. A chaque fois, il est aisé de repérer, parmi les éléments du groupe C, 3 chromosomes de morphologie particulière.
Ils sont submétacentriques et possèdent, au milieu du bras court et au premier tiers du bras long, une région faiblement colorée, assez longue. La partie distale du bras long est généralement divisée par une ou plus rarement deux bandes claires, moins prononcées que la première. Ces bandes pâles, correspondant probablement à une despiralisation de la chromatide, sont entourées de bandes sombres, où la chromatide serait à l'inverse, normalement spiralisée. L'élongation de ces 3 chromosomes, bien que susceptibles de variations d'amplitude, permet dans tous les cas de les différencier du quatrième X, de même morphologie générale mais dont les bandes claires sont beaucoup moins allongées (fig. 1).
Ces éléments sont très comparables aux chromosomes X observés dans les cellules normales à 46, XX [1] (fig. 1) : les trois premiers éléments correspondraient à l'X de réplication tardive, et le quatrième à l'X de replication précoce.
Fig. 1. - Montage des chromosomes
X de 4 cellules observées après traitement au BUDR : à 46,XX (à droite) ; à 48, XXXX (au centre) et à 46, Xi(Xq) (à gauche).
Cas à 45,X /46,X i(Xq).
L'analyse (les métaphases à 45 chromosomes confirme la présence d'un seul X. D'après son faible degré de despiralisation, cet élément peut correspondre à un X de réplication précoce (fig. 1).
Dans les cellules à 46 éléments, on reconnaît, en plus, un grand métacentrique différent des éléments du groupe A par sa segmentation particulière.
Les deux bras de ce chromosome sont identiques, caractérisés par la présence de deux constrictions importantes, divisant chaque bras en trois segments condensés.
Dans quelques cellules, l'exagération de la constriction proximale, plus longue que la distale, laisse supposer que cet élément peut correspondre à un X de réplication tardive.
2) Technique de dénaturation.
L'analyse par cette méthode est rendue difficile par le fait que l'X est un des chromosomes les moins bien marqués. Sa coloration générale est pâle et les bandes peu contrastées.
Cas à 48,XXXX.
La reconnaissance des 4 chromosomes X est aisée, nais il ne semble pas exister de différence notable de longueur entre ces éléments. Cependant, en raison du nombre restreint de cellules permettant une mesure correcte des 4 X, il n'a pas été possible de faire une analyse statistique.
La morphologie générale des X correspond assez bien à celle qui est observée avec la méthode précédente. Si l'on se limite aux bandes les mieux marquées, on voit qu'il existe au milieu du bras court, et au premier tiers proximal du bras long, une bande très pâle (fig. 2).
Cas à 45,X / 46,X i(Xq).
Dans les cellules à 45 éléments, on reconnaît l'X, dont la longueur est légèrement inférieure, en moyenne à celle des 7.
Dans les cellules à 46 chromosomes, on observe, en plus, an grand métacentrique qui peut, d'après son marquage et ses dimensions, correspondre à un isochromosome X.
La comparaison de la longueur moyenne des bras longs de L'X normal, à celle de la moyenne des bras de l'isochromosome X, dans 10 belles métaphases, ne révèle pas d'élongation relative ni de l'isochromosome, ni du bras long de l'X normal (fig. 2).
Cellules normales à 46,XX.
Afin de détecter une éventuelle différence de longueur entre les deux X normaux en métaphase, nous avons comparé les différences de longueur entre les deux chromosomes X d'une part, et entre les deux éléments de la paire 7, d'autre part.
La paire n° 7 a été choisie comme référence en raison de sa métrique, très voisine de celle des X.
L'analyse de 20 belles métaphases n'a pas permis de conclure que la différence de longueur entre les 2 X est en moyenne supérieure à celle qui existe entre les 7.
On ne peut donc reconnaître un X " court " et un X " long ", moins spiralisé.
Fig. 2. - Montage des chromosomes X de 4
cellules observées après dénaturation ménagée : à 46,XX (à droite) ; à 48,XXXX (au centre) et à 46,Xi(Xq) ( à gauche).
Discussion
1° Ces observations confirment les résultats précédemment obtenus, par l'emploi de BUDR [1,6] montrant que lorsqu'il existe deux ou plusieurs chromosomes X dans une cellule en division, ceux-ci réagissent différemment au traitement. Il est probable que les X dont la spiralisation est la moins marquée soient ceux dont la réplication est tardive. La simplicité de la méthode au BUDR devrait la faire préférer aux techniques d'autoradiographie, dont les applications sont comparables [5, 7].
A l'inverse, la technique de dénaturation permet une bonne identification des X, mais ne révèle pas de différence de leur condensation dans une même cellule en métaphase, après l'action de la colchicine.
Cela, n'exclut cependant pas qu'il puisse exister un asynchronisme de la contraction de ces chromosomes à une phase plus précoce comme la prophase. Une mesure grécise des chromosomes en prométaphase précoce sera effectuée ultérieurement.
2° La comparaison des images observées, avec chaque méthode, paraît fort intéressante. Avec la technique au BUDR le chromosome X est l'élément le mieux marqué par l'importance des zones de despiralisation. A l'inverse, avec la technique de dénaturation ménagée, l'X est l'élément le plus pâle du caryotype, et le contraste entre les bandes claires et sombres est assez faible. En métaphase, seules les bandes claires situées au milieu des bras courts, et au premier tiers proximal des bras longs sont régulièrement marquées. Ces zones pâles correspondent aux zones les plus despiralisées par l'action du BUDR.
Si l'on analyse des cellules en prophase, ou en prométaphase précoce, après dénaturation ménagée, d'autres bandes claires apparaissent dans la partie distale des bras longs en particulier.
La localisation de ces bandes correspond aux zones de despiralisation, après action du BUDR, bien visibles sur l'X à replication tardive (fig. 3).
Cette corrélation entre les lieux d'action des ces deux méthodes, aux principes apparemment très différents devrait apporter des informations précieuses sur l'origine du marquage chromosomique. Bien que l'on ne sache pas à quel niveau chimique ces méthodes agissent, il paraît plausible que l'action du BUDR sur des cellules vivantes, soit d'empêcher la formation d'un constituant chromosomique que la dénaturation thermique ménagée détruit ou modifie, sur des cellules fixées. Ainsi, le BUDR agissant avant fixation pourrait révéler des différences métaboliques entre les deux chromosomes X, alors que la dénaturation ménagée, survenant après fixation ne pourrait déceler cet effet dynamique.
Fig. 3. a) Représentation
schématique d'un X a réplication tardive, tel qu'il peut être vu à la figure
1. b) Représentation schématique d'un X, de noyau prométaphasique, après
dénaturation ménagée. c) chromosome X de 3 cellules différentes en
prométaphase après dénaturation ménagée.
Références
1. BARANOVSKAYA L.I., BENJUSCH V.A. (1972). - Differentiation along human chromosomes in relation tu their identification. II. X-chromosome. Cytologya (in press).
2. CARPENTIER S., LEJEUNE J. (1970). - Banque de cellules diploïdes humaines à caryotypes anormaux. Ann. Génét., 13, 135-140.
3. CARPENTIER S,, DUTRILLAUX B., LEJEUNE J. (1972). - Effet du milieu ionique sur la dénaturation thermique managée des chromosomes humains. Ann. Génét., 15, n°3, 203-205.
4. DUTRILLAUX B., LEJEUNE J. (1971). - Sur une nouvelle technique d'analyse du caryotype humain. C.R. Acad. Sci., 272, 2638-2640.
5. GIANELLI F. (1963). - The pattern of X chromosome deoxyribonucleic acid synthesis in two women with abnormal sex chromosome complements. Lancet, i., 7286, 863-865.
6. PALMER C.G. (1970). - 5-bromodeoxyurïdïne induced constrictions in human chromosomes. Canad. J. Genet. Cytol., XII, 4, 816-829.
7. RICCI N., DALLAPICCOLA B., VENTIMIGLIA B., TIEPOLO L., FRACCARO M. (1968). - 48, XXXX/49, XXXXX mosaic : asynchronies among the late replicating X chromosomes. Cytagenetics, 7, 4, 249-259.
8. ZAKHAROV A.F., SELEZNEV J.V., BENJUSCH V.A., BARANOVSKAYA L.I., DEMINTSEVA V.I. (1971). - Differentiation along human chromosomes in relation to their identification. Excerpta Medica, International Congress series, 233, 193.
9. ZAKHAROV A.F., BARANOVSKAYA L.I., DEMINTSEVA V.U., IBRAIMOV A.I. (1972). - Differentiation along human chromosomes in relation to their identification. I. General picture of differentiation induced, by 5-bromodeoxyuridine. Cytologya (in press).