Cytogénétique - Coloration des chromosomes humains par l'acridine orange après traitement par le 5 bromodéoxyuridine.
M. Bernard Dutrillaux, Mme Colette Laurent, MM. Jérôme Couturier et Jérôme Lejeune (1), présenté par M. J. André Thomas.
C.R. Acad. Sc. Paris, t. 276 (13 juin 1973). Séance du 9 mai 1973.
Sommaire
La coloration par l'acridine orange de chromosomes préalablement traités par le 5 bromodéoxyuridine (BUDR) net en évidence un marquage très fin, particulièrement utile pour l'analyse d'éléments peu différenciés par les autres méthodes.
L'introduction de BUDR dans la culture empêche la condensation de certains segments de chromatides. Colorés par le colorant de Giemsa, les chromosomes apparaissent porteurs de régions plus ou moins sombres, permettant de reconnaître certains d'entre eux [(2), (3)]. La méthode est particulièrement utile pour l'identification des chromosomes X (4). Cependant, bon nombre de chromosomes restent peu ou pas marqués.
Récemment, nous avons montré que l'acridine orange mettait en évidence des bandes R sur les chromosomes, en dehors de tout traitement préalable (5).
En conjuguant les deux méthodes, il apparaît que les effets de marquage se renforcent remarquablement.
Matériel et méthodes.
1. Traitement par le BUDR.
Nous avons repris exactement le protocole décrit par Zakharov et coll. (3) : 7 h avant la fin de la culture, le BUDR est introduit en solution dans du milieu physiologique, de façon que la concentration finale soit voisine de 200 µg /ml de milieu de culture. 2 h 30 avant la fin de la culture, de la colchicine est ajoutée, à la concentration finale de 0,04 µg/ml La dernière partie de la technique est identique à celle qui est habituellement utilisée au laboratoire [(6), (7)].
2. Coloration par l'acridine orange.
Les préparations sont hydratées progressivement par des bains successifs d'alcool à 90, 70 et 50°). Elles sont ensuite rincées à l'eau distillée, puis colorées pendant 20 mn dans une solution à 5 mg d'acridine orange pour 100 ml de tampon phosphate à pH 6,7 (5).
3. Observation microscopique.
On utilise un microscope il fond noir, muni d'un objectif x 100 à iris. L'excitation est faite en lumière ordinaire, avec une lampe survoltée ; un filtre " Kp 500 " (Zeiss) élimine tous les rayonnements, à l'exception de ceux proches de l'ultraviolet ; enfin, on interpose un filtre d'arrêt " 50 " (Zeiss). La photographie des mitoses est effectuée avec un film " Kodak microfile ", avec un temps d'exposition de 2 à 3 mn et le tirage est fait sur papier " G 3 " (Kodak).
Il est possible de pratiquer auparavant une coloration par le colorant de Giemsa, afin de repérer les mitoses en lumière ordinaire, et de comparer les résultats obtenus avec l'une et l'autre coloration.
Résultats.
Les chromosomes émettent une fluorescence verte, intense, et parfois aussi une faible fluorescence orangé, instable. La fluorescence verte, d'abord un peu diffuse, devient mieux localisée après quelque temps d'illumination et reste stable plusieurs minutes.
Si l'on a pris soin de photographier préalablement les mitoses, après une simple coloration par le colorant de Giemsa, leur comparaison avec la coloration à l'acridine orangé permet les conclusions suivantes :
- Les segments chromosomiques fortement colorés par le colorant de Giemsa sont ceux qui émettent la vive fluorescence verte.
- Inversement, les segments non condensés et non colorés par le colorant de Giemsa, n'émettent pas de fluorescence verte, mais peuvent émettre une faible fluorescence rouge instable.
La discrimination entre segments condensés et non condensés est beaucoup plus précise qu'après la seule coloration au colorant de Giemsa.
De plus, le marquage en bandes R (8) est très net, même pour les chromosomes dont la condensation ne semble pas avoir été modifiée par le BUDR comme les paires 21 et 22 : il devient aisé de reconnaître toutes les paires chromosomiques.
Discussion
La méthode se révèle particulièrement efficace pour l'analyse de certains éléments du caryotype, en particulier des chromosomes 4, 5 et X.
Le marquage observé correspond de toute évidence aux bandes R, mais il existe quelques différences de détail.
D'une part, la segmentation des chromosomes induite par le BUDR survenant dans les bandes R négatives (n'émettant pas la fluorescence verte) est inégale : elle modifie non pas la séquence, mais les distances relatives entre les bandes R positives. Par exemple, sur le chromosome 5, les bandes p11 et p13 restent fusionnées, alors que les bandes p13 et p15 sont très espacées.
D'autre part, les intensités relatives de fluorescence verte des bandes R positives sont modifiées. Bar exemple, sur le chromosome 12, les bandes q13 et q24 sont normalement très colorées, alors que les bandes q15 et q22 ne le sont que faiblement.
Après le traitement par le BUDR, ces 4 bandes émettent toutes une vive fluorescence verte, d'intensité comparable.
D'une façon générale, toutes les bandes R positives, mais habituellement pers colorées, gagnent en intensité après le traitement par le BUDR. L'amélioration du marquage de certains segments, comme le bras long des chromosomes 4 et 5, provient donc du renforcement de la coloration de bandes R positives et de la segmentation qui, survenant dans les bandes R négatives, accentue le contraste d'ensemble.
D'après le principe généralement admis de la coloration par l'acridine orange, on peut conclure que le BUDR modifie la structure chromosomique de façon à diminuer la polymérisation de l'acridine orange (fluorescence rouge) et, plus généralement, la fixation de ce colorant à l'emplacement des bandes R négatives.
Dans l'ignorance où nous sommes du mécanisme d'action réel du BUDR et du substrat coloré par l'acridine orange, rien ne permet de savoir si le BUDR intervient directement, soit sur l'ADN (substitution de la thymidine), soit sur les autres constituants chromosomiques (protéides), ou encore sur les interactions ADN-protéines.
Explication de la planche
Caryotype d'un sujet XXXY, observé après traitement par le BUDR et coloration à l'acridine orange.
Remarquer la finesse du marquage des chromosomes 4 et 5 en particulier, la condensation plus accentuée de l'un des chromosomes X, et l'élongation de certaines constrictions secondaires (chromosomes 1 et 9).
Planche I.
Références
(1) Avec la collaboration technique de M. Lombard et A. M. Fosse.
(2) C. G. PALMER, Canad. J. Genet. Cytol., 12, 1970, p. 816.
(3) A. F. ZAKHAROV, J. V. SELEZNEV, V. A. BENJUSCH, L. T. BARANOVSKAYA et V. I. DEMINSTSEVA, Excerpta Medica, Int. Congress Series, 233, 1971, p. 193.
(4) L. T. BARANOVSKAYA, A. F. ZAKHAROV, B. DUTRILLAUX, S. CARPENTIER, M. PRIEUR et J. LEJEUNE, Ann. Génét., 15, 1972, p. 271.
(5) J. COUTURIER, B. DUTRILLAUX et J. LEJEUNE, Comptes rendus, 276, Série D, 1973, p. 339.
(6) B. DUTRILLAUX et J. COUTURIER, Monographie annuelle Soc. Biol. Clin., 1972, p. 5.
(7) R. TURPIN et J. LEJEUNE, Les chromosomes humains, Gauthier-Villars, Paris, 1965.
(8) B. DUTRILLAUX et J. LEJEUNE, Comptes rendus, 272, Série D, 1971, p. 2638.