Analyse chromosomiques des tumeurs malignes

Sophie Carpentier et J. Lejeune ; avec la collaboration technique de Mme COLTEY 1

Carpentier Sophie, Lejeune J., 1973. - Analyse chromosomique des tumeurs malignes. Technique d'examen des tumeurs en culture organotypique. (Path.-Biol., 21, n°6, 665-666)


Résumé :

Dans le cadre d'une étude systématique des problèmes techniques posés par l'analyse chromosomique des tumeurs malignes, les auteurs abordent ici les problèmes des tumeurs maintenues en culture organotypique et proposent une technique permettant l'analyse de ce type de tumeur avec une grande régularité et une bonne qualité des résultats.

Sommaire

L'ANALYSE chromosomique des tumeurs malignes présente un triple intérêt : contrôle de la stabilité ou de la transformation dune tumeur, étude des stades initiaux de la carcinogénèse, découverte d'éventuelles anomalies caractéristiques comme l'ont été le chromosome Philadelphie de la leucémie myéloïde, le chromosome marqueur de certaines tumeurs de l'ovaire, le chromosome C supplémentaire d'une variété de lymphomes (9, 8, 4).

Cependant l'analyse des chromosomes tumoraux se heurte sur le plan pratique à certains problèmes techniques qui en limitent l'utilisation : difficulté d'obtention à l'examen direct de mitoses analysables, fréquence en milieu de cultures d'une prolifération conjonctive étouffant la lignée cancéreuse, etc. Par ailleurs la nature même du tissu tumoral le rend peu accessible aux méthodes d'analyse chromosomique couramment utilisées pour les autres variétés de tissus.

Dans le cadre d'une étude de ces différents problèmes en vue de la mise au point de méthodes réellement fidèles et efficaces d'examen des caryotypes tumoraux, nous avons abordé dans un premier temps l'analyse des tumeurs en culture organotypique.

Et. et Em. Wolff ont mis à notre disposition 2 cultures de longue durée de tumeurs prélevées chirurgicalement chez l'Homme. L'une Z 200 est une culture d'une métastase hépatique dont les caractères chromosomiques ont été précisés antérieurement par J. de Grouchy et Em. Wolff (5). L'autre AZ 110 provient d'un épithélioma humain du côlon ascendant (11, 12, 13). Le but de cette Note est seulement d'exposer la technique qui avec ce type de tumeur nous a donné les meilleurs résultats.

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Technique (fig. 1)

Les nodules tumoraux maintenus en culture organotypique de longue dure sont traités entre le 3e et le 5e jour après un repiquage, stade ou l'index mitotique est optimum.

1) Ils sont soumis d'abord à un traitement à la colchicine pendant 2 h à 37°, en recouvrant les nodules en place, d'une solution physiologique (P.B.S., tyrode ou Gey) additionnée de 0,1 mg % de colchicine (colchineos Houdé).

2) La dissociation mécanique et chimique des nodules constitue un temps essentiel, qui permet la libration d'un maximum de cellules isoles. Les nodules traités â la colchicine sont déposés dans une boîte de Pétri contenant 2 à 3 ml de solution de trypsine à 0,2 % (trypsine Difco 1 /250) dans du P.B.S. ou solution de Gey.

Ils sont fragmentés soit par sections multiples au bistouri, ou mieux par écrasement sur une surface rugueuse permettant une dilacération complète. Pour cela, les nodules sont déposés avec une goutte de solution de trypsine, sur une lime très fine en acier fondu, et écrasés au moyen d'une lame de bistouri (7). La suspension d'îlots cellulaires obtenus, après avoir pris soin de détacher les fragments restés adhérents à la lime, est transférée dans un tube à fond cônique et mise à 37° pendant 20 minutes. L'action chimique de la trypsine est améliorée si l'on agite le milieu avec une pipette Pasteur, toutes les 5 minutes. Après ce délai, on laisse décanter la suspension pendant quelques minutes dans le tube en position verticale. Le surnageant est stocké à 4°. Le culot est remis en suspension dans 3 ml de solution de trypsine et placé à 37° pendant 15 minutes. Les 2 lots de cellules sont ensuite réunis et centrifugés 5 minutes à 800 trs/minute. La solution de trypsine est alors éliminée.

3) La 3e phase du traitement est conforme aux techniques déjà publiées (10, 2) ; elle comporte un choc hypotonique qui permet d'obtenir la dispersion des chromosomes à l'intérieur de chaque cellule en mitose. Le culot cellulaire obtenu par centrifugation est remis en suspension dans 5 à 8 ml de liquide hypotonique constitué de la façon suivante :

Eau bidistillée : 50 ml

Sérum Poulain : 10 ml

Solution de CI2Mg (*) : 0,5 ml

Hyaluronidase (**) : 3ml

Ce traitement dure 25 minutes à 37°.

Le liquide hypotonique est ensuite éliminé par centrifugation (5 mn à 800 trs/mn).

4) Fixation. Une première fixation est réalisée par remise en suspension du culot cellulaire dans le mélange de Carnoy (6 : 3 : 1) pendant 25 minutes à la température du laboratoire ; après centrifugation et élimination du fixateur, le culot est repris dans le deuxième fixateur éthanol acétique (3 : 1) pendant 15 minutes.

Après une nouvelle centrifugation, le fixateur est éliminé et le culot est délicatement remis en suspension dans 2 gouttes d'éthanol acétique.

5) L'étalement est fait sur des lames humides stockées préalablement à + 4°C dans de l'eau bidistillée pendant 15 minutes. Un fait tomber 2 gouttes de la suspension cellulaire sur chaque lame égouttée. Les lames sont mises à sécher en position horizontale.

6) Coloration. Les lames sont plongées pendant 10 minutes dans le liquide de Giemsa à la dilution suivante :

Solution de Giemsa R : 4 ml

Tampon phosphate à pH 6,7 : 4 ml

Eau bidistillée : 92 ml

Les lames sont ensuite rincées quelques secondes à l'eau courante et après séchage à l'air libre, l'examen microscopique peut être pratiqué (fig. 2).

Il est indispensable de compléter l'examen morphologique habituel par une analyse des " bandes chromosomiques " obtenues par dénaturation thermique ménagée suivant une méthode précédemment décrite (3) (1). Les lames déjà colorées peuvent être soumises à ces traitements (6).

L'observation microscopique de ces bandes se fera de préférence au contraste de phase, en utilisant un filtre orange pour les prises de vue photographiques (fig. 3).


Fig. 1 - Diagramme résumant les différentes étapes du traitement de la tumeur.


fig. 2 - Chromosomes de la tumeur AZ 110 après éclatement et coloration au Giemsa.


Fig. 3 - La technique de dénaturation fait apparaître un marquage chromosomique permettant une meilleur identification des différentes paires chromosomiques.


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Notes

(*) Formule de la solution de chlorure de magnésium : Cl2Mg, 6H2O : 20,33 g. Eau bidistillée 1000 ml.

(**) Hyaluronidase CHOAY.

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Références

1. CARPENTIER S., DUTRILLAUX B., LEJEUNE J., 1972. - Effet du milieu ionique sur la dénaturation thermique ménagée des chromosomes humains. Ann. Génét., 15, 3.

2. CARPENTIER S., LEJEUNE J., 1970. - Banque de cellules diploïdes humaines à caryotypes anormaux. Ann. Génét., 13, 135-140.

3. DUTRILLAUX B., LEJEUNE J., 1971. - Sur une nouvelle technique d'analyse du caryotype humain. C. R. Acad. Sci. (Paris), 272, 2368.

4. GARIEPY G., CADOTTE M., 1970. - Lymphome malle caractérisé par une trisomie C. Ann. Génét., 13, n° 2, 112.

5. De GROUCHY J., WOLFF Em., 1969. - Analyse chromosomique d'une tumeur cancéreuse humaine en culture organotypique. Europ. J. Cancer, 5, 159-163.

6. LAURENT C., DUTRILLAUX B., BINDER P., 1972 - Application de la méthode de dénaturation ménagée : dénaturation de préparations antérieurement colorées. Ann. Génét., 15, 3.

7. LEJEUNE J., BERGER R., CARPENTIER S., 1968. - Dispositif de dissociation d'un tissu en îlots cellulaires séparés. Ann. Génét., 11, 68.

8. LEJEUNE J., BERGER R., 1966. - Sur une méthode de recherche d'un variant commun des tumeurs de l'ovaire. C.R. Acad. Sci. (Paris), 262, 1885-1887.

9. NOWELL P. C., HUNGERFORD D. A., 1969. - Chromosome studies on normal and leukaemic human leukocytes. J. nat. Cancer Inst., 25, 85-109.

10. TURPIN R., LEJEUNE J., 1965. - Les chromosomes humains. Gauthier Villars éd., Paris.

11. WOLFF Et., WOLFF Em., 1965, - Développements récents de la culture organotypique de deux tumeurs humaines d'origine digestive. Presse méd., 73, 20, 1157-1162.

12. WOLFF Et., WOLFF Em., 1966. - Cultures organotypiques de longue durée de deux tumeurs humaines du tube digestif. Europ. J. Cancer, 2, 93-103.

13. WOLFF Em., SMITH J., WOLFF Et., 1972. - Etude expérimentale d'une nouvelle tumeur maligne humaine du côlon ascendant en culture organotypique de longue durée. C. R. Acad. Sci. (Paris), 274, 341-345.