Génétique. - Augmentation d'activité de la superoxyde dismutase érythrocytaire dans la trisomie pour le chromosome 21.

MM. Pierre-Marie Sinet, Daniel Allard, Jérôme Lejeune et Henri Jérôme, présentée par M. J. André Thomas.

C. R.. Acad. Sc. Paris, t. 278 (17 juin 1974). Série D - 3267


Sommaire

La localisation du gène de la superoxyde dismutase A sur le chromosome 21 étant connue, il est montré due la trisomie pour ce chromosome provoque une augmentation de l'activité enzymatique érythrocytaire.

L'augmentation de diverses activités enzymatiques cellulaires a été antérieurement décrite dans la trisomie 21 (8). Toutefois l'hypothèse d'une localisation des gènes de structure ou de régulation de ces enzymes sur le chromosome 21 n'a jamais été vérifiée.

Par la méthode d'hybridation cellulaire, Tan et coll. (14) ont localisé sur le chromosome 21 le gène de l'indophénol oxydase A, enzyme précédemment étudié par Brewer (3) qui distingue deux formes A et B. Les observations de Beauchamp et Fridovich (1), Lippitt et Fridovich (10) et Beckman et coll. (2) les autorisent à affirmer l'identité de l'indophénol oxydase avec la superoxyde dismutase (SOD) qui catalyse la réaction :

2O2.- + 2 H+ ? H2O2+ O2.

La SOD existe sous deux formes, la forme A, cytoplasmique, dimérique, présente dans tous les tissus étudiés à l'exclusion du polynucléaire et la forme B, mitochondriale, tétramérique, présente dans tous les tissus étudiés, à l'exclusion de l'érythrocyte et localisée sur le chromosome 6 par Creagan et coll. (4).

Connaissant la localisation de l'indophénol oxydase A sur le chromosome 21, nous avons systématiquement étudié l'activité de la SOD A dans les érythrocytes des trisomiques 21 et Sichitiu et Coll. (12) l'indophénol oxydase par électrophorèse en gel d'amidon.

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Sujets et méthodes

Les sujets sont étudiés par paires comportant un trisomique 21 et un témoin. Dix trisomiques 21, sans cardiopathie congénitale, sont comparés à dix témoins normaux. Dans les deux catégories, les âges se répartissent entre cinq ans et l'âge adulte.

Pour la préparation de l'échantillon, le sang est recueilli sur EDTA dipotassique. 2 H2O (10 mg pour 5 ml). Les érythrocytes sont séparés et lavés trois fois dans NaCl 15,4 x 10 -2 M, puis lysés par congélations et décongélations successives. L'hémolysat est dilué dans l'eau pour obtenir une concentration en hémoglobine de 100 g/litre. L'hémoglobine est éliminée par addition à 1 ml de lysat, sous agitation continue à 4°C, de 0,25 ml d'éthanol et 0,15 ml de chloroforme et, après 30 mn, de 0,15 ml d'eau. Le surnageant incolore obtenu par centrifugation contient l'activité SOD.

Pour la mesure de l'activité SOD, les cuves contiennent dans un volume de 3 ml maintenu à 25°C et équilibré avec l'air : bleu nitrotétrazolium (SIGMA grade III) 2,7 x 10-5 M, gélatine (MERCK) 0,2 mg, EDTA disodique 10-4M, phénazine méthosulfate (SIGMA) 3 X 10-6M, xanthine (SIGMA) 1,3 x 10-4 M, tampon phosphate mon opotassique-disodique pH 7,82 x 10-2M et 5, 10 au 15 µl de l'échantillon à étudier. La quantité de xanthine oxydase (SIGMA) introduite dans la cuve est telle qu'en l'absence de SOD l'augmentation de DO à 540 nm, correspondant à la réduction du NBT, soit de 0,0230 par minute. Dans ces conditions l'unité est définie comme la quantité de SOD réduisant cette pente de 50 %.


Pourcentage d'inhibition de la réduction du bleu nitrotétrazolium en fonction de la quantité d'hémoglobine contenue dans l'échantillon étudié. Les points et barres représentent les moyennes et écarts pour les dix sujets étudiés.

Comparaison des activités SOD A dans les érythrocytes des sujets témoins et trisomiques 21
SujetsNbunités SOD par mg Hb
Mssm
témoins tisomiques 21100,7790,0750,022
101,0920,0850,026
t = 9, 92 ; p<<0,001

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Résultats

Pour chaque dosage l'activité SOD est donnée par la moyenne des pourcentages d'inhibition obtenus avec 5, 10 et 15 µl d'échantillon. Le pourcentage d'inhibition est linéairement proportionnel au volume d'échantillon, mais au-delà de 60 % la courbe s'infléchit (fig.). Les valeurs supérieures à 60 %, généralement obtenues avec 15 µl d'échantillon chez les sujets trisomiques 21, ne sont pas prises en considération dans le calcul de l'activité SOD. Les résultats sont exprimés en unités d'activité SOD par milligramme d'hémoglobine avant le traitement d'élimination et en négligeant les modifications de volume résultantes, qui sont toujours identiques.

L'activité SOD est significativement augmentée chez les sujets trisomiques 21. (tableau).

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Discussion

La technique utilisée pour la mesure de l'activité SOD est fondée sur l'inhibition de la réduction du bleu nitrotétrazolium par les radicaux superoxydes formés lors de l'oxydation de la xanthine par la xanthine oxydase. Elle dérive des méthodes proposées par Fried [(5), (6)] et par Beauchamp et Fridovich (1). Toutefois l'application de cette technique à des lysats érythrocytaires bruts est impossible en raison de l'affinité de l'hémoglobine pour les radicaux superoxydes (7). En conséquence l'hémoglobine est éliminée par précipitation avec un mélange de chloroforme et d'éthanol selon le procédé de Tsuchihaschi (15) modifié par McCord et Fridovitch (11).

Devant l'augmentation hautement significative de l'activité SOD chez les trisomiques 21 des causes accessoires ont été envisagées et peuvent être éliminées. Ainsi que l'ont montré Sparkes et Baughan (13), les sujets trisomiques 21 ne se distinguent pas des témoins pour les valeurs hématologiques suivantes : teneur en hémoglobine du sang, valeur de l'hématocrite, nombre d'érythrocytes, volume globulaire moyen, teneur globulaire moyenne et concentration globulaire moyenne en hémoglobine. De même Layzer et Epstein (9), étudiant les profils de densité, ont constaté que les érythrocytes n'étaient pas immatures chez les sujets trisomiques 21. Ils sont au contraire plus denses, mais ne se distinguent pas significativement de ceux des témoins.

Il reste qu'à l'intérieur de chaque échantillon la variance est remarquablement faible, ce qui suggère un déterminisme génétique précis. Si l'excès d'activité était proportionnel au dosage génique, le rapport des activités enzymatiques entre trisomiques 21 et témoins devrait être de 1,5. La valeur observée de 1,41 ± 0,08 (M ± s), pour les couples de mesures appariées chronologiquement, est bien de l'ordre de grandeur attendue. Toutefois elle est significativement inférieure au chiffre théorique (P < 0,01).

En conclusion, l'augmentation de l'activité SOD A érythrocytaire chez les sujets trisomiques 21 pourrait constituer le premier exemple chez l'Homme de l'effet enzymatique cellulaire d'un surdosage génique (16).


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Notes

(1) C. BEAUCHAMP et I. FRIDOVICH, Anal. Biochem., 44, 1971, p. 276.

(2) G. BECKMAN, E. LUNDGREN et A. TÄRNVIK, Human Hered., 23, 1973, p. 338.

(3) G. J. BREWER, Amer. J. Hum. Genet., 9, 1967, p. 674.

(4) R. CREAGAN, 3. TISCHFIELD, F. RICCIUTI et F. H. RUDDLE, Humangenetik, 20, 1973, p. 203.

(5) R. FRIED, Anal. Biochem., 16, 1966, p. 427.

(6) R. FRIED, Communication personnelle sur la mesure de la superoxyde dismutase, 1974.

(7) H. A. O. HILL, D. R. TURNER et G. PELLIZER, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 1974, p. 739.

(8) D. Y.-Y. HSIA, P. JUSTICE, G. F. SMITH et R. M. DOWBEN, Amer. J. Dis, Child., 121, 171, p. 153.

(9) R. B. LAYZER et C. J. EPSTEIN, Amer. J. Hum. Genet., 24, 1972, p. 533.

(10) B. LIPPITT et I. FRIDOVICH, Arch. Biochem. Biophys., 159,1973, p. 738.

(11) J. M. MCCORD et I. FRIDOVICH, J. Biol. Chem., 244,1969, p. 6049.

(12) S. SICHITIU, P.-M. SINE, J. LEJEUNE et J. FREZAL, Humangenetik, 1974 (sous presse).

(13) R. S. SPARKERS et M. A. BAUGHAN, Amer. J, Hum. Genet., 21, 1969, p. 430.

(14) Y. H. TAN, J. TISCHFIELD et F. M. RUDDLE, J. Exp. Med.,137,1973, p. 317.

(15) M. TSUCHIHASHI, Biochem. Z., 140, 1923, p. 65.

(16) Ce travail a bénéficié de la collaboration technique de M. Philippe Parvy et a été réalisé avec l'aide de l'INSERM, du CNRS (Équipe de Recherche associée n° 47), du Conseil Scientifique de la Faculté de Médecine Necker-Enfants Malades et de la Fondation pour la Recherche Médicale Française.