Surdosage de la forme dimérique de l'indophénoloxydase dans la trisomie 21, secondaire au surdosage génique

S. Sichitiu1, P. M. Sinet2, J. Lejeune2, et J. Frézal3

Humangenetik 23, 65-72 (1974)


Résumé :


Sommaire

Zusammenfassung : Tan et al. haben durch Hybridisierung somatischer Zellen von Mensch und Maus zeigen können, dass das Gen, welches die Synthese der dimeren Form der Indo-phenoloxydase kontrolliert, aufdem menschlichen Chromosom 21 lokalisiert ist. Angeregt durch diese Arbeit, haben wir die Aktivität dieses Enzyms bei 11 Individuen mit Down-Syndrom und 11 Kontrollen untersucht (Aller von 2 bis 20 Jahren). Die Enzym-bestimmungen wurden mit Hilfe der Stärkegelektrophorese von Hämolysaten identischer Hämoglobingehalte durchgeführt. Die Elektrophorese wurde mit einem Sebia-CeIlomatic-Gerät ausgewertet und jeder Punkt in der Auswertung mit einem Standard-HämogIobinfleck verglichen. Die Ergebnisse zeigen eine statistisch signifikante Vermehnmg der dimeren Form von IPO bei Patienten mit Trisomie 21 entsprechend einem Gendosiseffekt.

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Introduction

La compréhension des perturbations des mécanismes cellulaires, conséquence d'un surdosage génique est d'un intérêt important pour la biologie.

Un tel modèle est réalisé dans la trisomie 21 (Lejeune et coll., 1959; Lejeune, 1966).

Différentes modifications biochimiques ont été observées dans la trisomie 21 qui portent sur le métabolisme du tryptophane (Jérôme et col., 1960; Mc Coy et Chung, 1964; Vassella et col., 1968), la sérotonine plasmatique et plaquettaire (Rosner et coll., 1965; Berman et coll., 1967; Jérôme et coll.,1970), les acides aminés sanguins (Sinet, 1972) et du liquide cérébrospinal (Priscu et coll., 1969, 1974).

Cependant, il reste difficile de relier ces altérations à la trisomie, c'est à dire à la présence de certains gènes en trois exemplaires.

D'une part l'observation que certaines activités enzymatiques sont élevées dans la trisomie 21 (Hsia et coll., 1971) et sensiblement, du moins pour certaines, dans le rapport 3/2, d'autre part le fait que l'activité enzymatique chez les hétéro-zygotes pour le gène d'une erreur du métabolisme, qui sont en quelque sorte des haploïdes fonctionnels, est à peu près égale à la moitié de l'activité des homo-zygotes normaux, tout ceci a pu suggérer une localisation des gènes contrôlant ces activités sur le chromosome 21.

Toutefois, une telle explication a du être abandonnée quand il fut constaté que le même phénomène concerne des activités gouvernés par des gènes dont les locus ne sont pas portés par le chromosome 21, comme la glucose-6-phosphate déshydrogénase, liée au sexe, la 6-phosphogluconate déshydrogénase des hématies (chromosome 1) etc.

Au surplus ce taux élevé d'activité n'est pas retrouvé dans toutes les lignées cellulaires du trisomique. Certes l'intervention de gènes régulateurs portés par le chromosome 21 sont des hypothèses commodes pour rendre compte de ces deux ordres de constatation. D'autres explications restent plus probables comme celles qui invoquent la modification de la durée de vie des cellules (Raab et coll., 1966) ou l'influence des facteurs hormonaux (Mc Coy et Ebadi, 1966).

En définitive ces résultats soulignent essentiellement la complexité des phénomènes liés au surdosage génique et la difficulté de leur compréhension.

En ce domaine l'assignement par la technique de l'hybridation cellulaire de certains locus à des chromosomes ouvre une nouvelle voie expérimentale. Dès lors que la localisation d'un gène est connue on peut en effet vérifier si un surdosage génique accroît ou non l'activité de l'enzyme qu'il contrôle.

Tel est l'objet du présent travail.

Tan et coll. (1973), à l'aide d'hybrides homme-souris, ont localisé sur le chromo-some 21 les gènes contrôlant la protéine anti virale ainsi que la forme dimérique de l'indophenol oxydase (en abrégé: LP.O). Cette dernière enzyme a été identifiée en 1967 par Brewer sur électrophorèse en gel d'amidon de divers extraits tissulaires après coloration par des sels de tetrazolium. L'I.P.O oxyde ces composée en produisant des taches achromatiques et pour cette raison elle est aussi appelée tetrazolium oxydase.

La nature de ce système enzymatique est mal connue. D'après Brewer (1967, 1970), l'I.P.O se rapprochait des oxydases solubles décrites par Yonetani (1963), ayant la capacité d'oxyder le cytocrome C réduit, mais ayant des constantes physiques différentes.

Dans cette note, nous rapportons les résultats obtenus de l'étude de l'I.P.O dimère par la technique de Brewer sur des hémolysats de globules rouges prélevées sur des trisomiques 21.

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Matériel et méthodes

11 sujets trisomiques 21 libres, dont le caryotype a été contrôlé, ont été comparés à 11 sujets normaux. L'âge des sujets testés varie entre 2 et 20 ans. Pour les études enzymatiques, nous avons utilisé des extraits érythrocytaires obtenus par congélation et décongélation répétées (-60° C) des culots globulaires après élimination des leucocytes et des plaquettes et lavage dans Nacl 9p. 1000 (Shows et coll., 1964).

La teneur en hémoglobine de chaque extrait est mesurée par la méthode spectrophotométrique de Drabkin (1935) (ces dosages ont été effectués par Mr. Jamet J. P. (Laboratoire d'hématologie Hôpital des Enfants Malades) que nous remercions). L'électrophorèse en gel d'amidon de ces hémolysats est effectuée selon la technique de Brewer (1967) avec les modifications suivantes: migration horizontale, temps d'exposition a la lumière au cours de la coloration limité à une heure. Les plaques d'électrophorèse sont ensuite photographiées dans des conditions standardisées (éclairage, agrandissement, diaphragme) sur pellicule KODAK panatomic X, format 6x6. Les négatifs photographiques sont lus à l'aide d'un lecteur d'électrophorèse cellomatic SEBIA A partir des tracés obtenus, on mesure les surfaces des pics correspondants aux taches d'enzyme et d'hémoglobine. Nous avons procédé aussi à la mesure directe de la surface des tâches d'hémo-globine sur positifs photographiques, car la variabilité de l'hémoglobine réduite d'un extrait à l'autre peut intervenir dans la lecture de la densité optique.

Par des essais préliminaires nous avons établi que la variation de la mesure de l'enzyme en fonction de la mesure de l'hémoglobine n'est linéaire que pour de faibles quantités d'hémo-globine (de 0 à 50 µg) (fig. 1). Pour respecter au mieux ces concentrations, nous avons fait migrer 20 µl et 10µl d'hémolysat pour chaque sujet.

Du fait de l'existence de nombreux facteurs incontrôlables pouvant varier d'une électrophorèse à l'autre, nous avons comparé sur chaque gel (fig. 2) un témoin et un trisomique 21 de même âge. Les taux d'hémoglobine des extraits ainsi comparés sont préalablement égalisés par dilution dans Nacl 9p. 1000.

Comme on le voit sur les tableaux 1 et 2, les mesures de l'hémoglobine confirment cette égalisation puisque la moyenne des rapports Hb M/Hb T ne diffère pas de 1. La répartition des hémolysats sur chaque plaque est faite de façon aléatoire.


Fig. 1. - Courbes étalon. M Trisomiques 21. T Témoin


Fig. 2 a-d. - Exemple d'électrophorèse comparative. a, c Extraits de trisomique 21. b, d ex-traits de témoin. a, b migration de 20 µl d'hémolysat. c, d migration de 10 µl d'hémolysat.

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Résultats

L'activité enzymatique d'I.P.O est exprimée par le rapport :

R = Surface enzyme / Surface hémoglobine

Dans les tableaux 1 et 2 sont figurés les données concernant les deux concentrations des extraits utilisés. Les résultats statistiques confirment l'hétérogénéité entre plaques, mais révèlent également une différence significative entre trisomiques et témoins (voir tableau 3) (0,01 < P< 0,001).

Nous avons calculé pour chaque comparaison, le rapport de l'activité enzymatique du trisomique 21 sur celle du témoin (Phi RM/RT).

En comparant les moyennes, il apparaît que le t du student est plus élevé pour 10 µl que pour 20 µl. Comme cette dernière quantité est à la limite de linéarité de la courbe d'enzyme en fonction de l'hémoglobine (fig. 1) le meilleur protocole d'examen correspond à la migration de 10 µl d'hémolisat.

Tableau 1. - Les résultats concernant les extraits de 20µl.
Plaque n°Age et sexeHémoglobineHémoglobine mesurée (mm)2HbM / HbTR=[Enz. (mm)2/Hb mesuré]x103RM/RT
MTMTMTMT
116M23F4843700'15851,204343373,29
424^2792,407177061,02
23F2F54,454,712309381,3113085,21,53
4974011,243221991,62
310M13M51,251,65286710,795113731,37
4094850,846605151,28
417M17M4848,95275910,89660393 .1,68
35235719886491,52
59M8F51,2516955151,354754621,03
4094550,98065231,54
618M19F50,4516646291,063582991,20
5575171,084273481,23
72M2F44,846,85154861,066505211,25
3683261,139117761,17
86F6F5251,96245701,104333701,17
4764421,085674781,19
98M8F41,642,56956571,063423201,07
4574261,075214921,06
1011M15F54,754,46537550,872402540,95
3063900,795134931,04
117F7M50,551,27757421,046105701,07
416416111381017142
M = trisomiques 21. T = témoin. a Hémoglobine mesurée en densimétrie. b Hémoglobine mesurée par la surface de la tache.
Tableau 2. - Les résultats concernant les extraits de 10 µl
PIaque n°Hémoglobine en µgHémoglobine mesurée (mmm)2HbM / HbTR=[Enz.(mm)2/Hb mesurée] x103RM/RT
MTMTMT
12421,5445"3651,223983861,03
328b3390,975404161,30
227,227,86514331,502031041,95
3512721,293761662,27
325,625,83813751,024803311,45
3023400,896073651,66
42424,43724370,856834811,42
2342710,8610857741,40
525,625,54303881,116514101,59
3133260,968964881,84
625,225,531532614794231,13
2593020,865834581,27
722,423,42402910,839885431,82
2242320,9710606811,56
82625,94734471,065243041,72
3702901,286714691,43
920,821,23683521,055434261,28
3303131,056064801,26
1027,327,23664080,904043261,24
2352530,936305261,20
1125,225,65154031,286256081,03
3082921,0610458391,25
a Hémoglobine mesurée en densimétrie. b Hémoglobine mesurée par la surface de la tache.
Tableau 3. - Analyse statistique
A
Variance33524aF1/10 = 10,95p < 1 %
Intra-plaque85813bF1/10 = 15,90p < 1 %
Variance42389aF10/10 = 13,84p < 1 ‰
Inter-plaques105817bF10/10 = 19,61p <' 1 ‰
Variance3062a
Résiduelle5396b
Phi ± (D.S.)1,24 (± 0,221)at = 3,52p < 1 %.
1,25 (± 0,213)bt = 3,97p < 1 %
B
Variance121659aF1/10 =15,46p < 1 %
Intra-plaque269953bF1/10 = 48,85p < 1 ‰
Variance50025aF10/10 = 6,36p < 1 %
Inter-plaques89418toF10/10 = 16,18p < 1 ‰
Variance7867a
Résiduelle5525b
Phi ± (D.S.)1,424 (± 0,313)at = 4,46p < 1 %
1,495 (± 0,325)bt = 5,06P < 1 ‰
A = Résultats pour les migrations de 20 µl d'extrait. B = Résultats pour les migrations de 10 µl d'extrait. a Hémoglobine mesurée en densimetrie. b Hémoglobine mesurée par la surface de la tache. Phi = RM/RT.

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Discussion

Le rapport Phi = 1,495 est proche du rapport de dosage génique 1,5. Cette observation correspond bien à ce que l'on pouvait attendre, compte tenu de la localisation du gène contrôlant la synthèse de l'I.P.O dimère sur le chromosome 21. Elle est aussi en harmonie avec les constatations faites chez les hétérozygotes pour des gènes, qui à l'état homozygote, ne déterminent aucune activité enzymatique décelable, comme par exemple le gène de la galactosémie. Elle suggère au surplus, dans l'hypothèse de Ford, que ce locus n'est pas inactivé (Ford, 1973).

Cependant deux ordres de remarques doivent être faites. En premier lieu, l'interprétation des observations n'est possible que dans la mesure où la localisation du gène sur le chromosome 21 peut être affirmée indépendamment des résultats des dosages comparés chez des trisomiques et des diploïdes puisque, comme nous l'avons rappelé, des observations comparables ont été faites pour des gènes non portés par le chromosome 21.

Toutefois, si la localisation est confirmée par des voies indépendantes, l'études des sujets porteurs soit d'une trisomie, soit d'une monosomie partielle, peut permettre une localisation plus précise de ce locus.

En second lieu il reste difficile d'apprécier la portée de cette observation qui suggérerait que l'I.P.O dimère échappe à un mécanisme de régulation. Il se pourrait en effet que l'activité de certaines enzymes soit identique, que le gène responsable soit en double ou en triple exemplaire, de même que certains hétérozygotes ont une activité enzymatique qui ne diffère pas de celle des homozygotes normaux correspondants comme c'est le cas pour certains variants de la catalase (Cantz et Suter, 1965; Aebi et Cantz, 1966). Un résultat négatif n'aurait donc pas permis de réfuter une localisation établie par d'autres méthodes.

Enfin, le rôle éventuel d'un tel trouble enzymatique dans la pathogénie de la trisomie 21, ne pourra être éclairci que par une meilleur compréhension de l'activité physiologique de cette enzyme.


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