Modification des chromatides avant fixation : production de bandes G par certains colorants

J. COUTURIER, J. LEJEUNE

COUTURIER J., LEJEUNE J. (1976). - Modification des chromatides avant fixation : production de bandes G par certains colorants. Ann. Génét., 19, n° 3, 217-218.


Résumé :

Résumé. - L'acridine orange, la coriphosphine, le bleu de toluidine et la pyronine, appliqués durant le choc hypotonique permettent un marquage chromosomique de type G, par coloratipn ultérieure des lames fixées. Outre une application pratique très simple, ces modifications subvitales des chromatides permettent d'étudier la configuration moléculaire qui détermine ces effets.

Sommaire

Pratiquement toutes les techniques de marquage chromosomique mises au point jusqu'à présent font appel à divers traitements des préparations chromosomiques fixées.

Il nous paraît cependant que le choc hypotonique est, a priori, un stade particulièrement intéressant puisque l'on peut espérer atteindre alors des structures chromosomiques non modifiées par la fixation.

Compte tenu de l'effet, déjà signalé [2], de l'acridine orange, nous avons étudié systématiquement l'action de molécules possédant une structure voisine.

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Matériel et méthodes

Les cultures de lymphocytes sont réalisées selon la technique habituelle [1].

Le milieu hypotonique est constitué de la façon suivante :

- sérum humain AB : 1 partie

- eau distillée : 5 parties

Au moment de l'emploi, l'un des colorants indiqués dans le tableau I a été ajouté. L'incubation des cellules dans ce milieu a lieu durant 20 minutes à 37°.

La fixation et l'étalement sont effectués selon la technique habituelle.

Les lames sont colorées 5 minutes au colorant de Giemsa dilué à 3 %.

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Résultats

Les produits suivants : acridine orange, bleu de toluidine, coriphosphine O et pyronine G, déterminent un marquage de type G, ainsi qu'un marquage particulièrement intense des régions hétérochromatiques (fig. 1).

La qualité des images est satisfaisante, les chromosomes n'apparaissant pas altérés par le traitement comme ils le sont par la plupart des méthodes habituelles de bandes G. On doit noter toutefois que l'effet du choc hypotonique sur la dispersion des chromosomes paraît diminué, ce qui rend un grand nombre de mitoses difficilement analysables.

Aucune différence de marquage n'a pu être mise en évidence avec les 4 colorants actifs employés.

La concentration du colorant dans le milieu hypotonique est un paramètre critique - la concentration efficace pour obtenir le marquage est spécifique de chaque colorant et ne semble pas souffrir de larges variations.

Comme l'indique le tableau, les produits suivants : acridine jaune, acriflavine, atébrine, aurophosphine, bleu de méthylène, ne déterminent aucun marquage chromosomique, quelles que soient les doses employées.

Tableau I - Les différents colorants étuidiés
Concentrations finales employées Bandes G
Acridine jaune1 mg/10 ml0
Acridine orange0,12 mg/10 ml+
Acriflavine 0,1 mg/10 mI0
Atébrine0,2 mg/10 ml0
Aurophosphine1 mg/10 ml0
Bleu de méthylène5 mg/10 ml0
Bleu de toluidine 0,10 mg/10 ml+
Coriphosphine0,10 mg/10 ml+
Pyronine G 2 mg/10 ml+


Fig. 1. - Caryotype masculin après traitement par la coriphosphine et coloration au Giemsa.

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Discussion

Les différents colorants étudiés peuvent être considérés comme des variantes d'une structure commune schématisée par la formule : dans laquelle X peut être :


soit N, soit NH, soit N-CH3, soit O, soit S ; les positions A et B pouvant être occupées ou non par des azotes différemment substitués.

Les quatre colorants permettant une mise en évidence des bandes G ont une configuration comparable de la région - A - X - B alors que les trois composés inactifs aurophosphine, acriflavine et atébrine, en différent notablement.

Le bleu de méthylène se rapprocherait fortement des corps actifs par sa région A - X - B, mais sa transformation bien connue en leucodérivé pourrait rendre compte de son inefficacité.

Afin de décider si la configuration de la zone A - X - B, joue bien un rôle décisif dans la mise en évidence des bandes G, divers colorants peuvent être étudiés. Par exemple la série des azurs, l'acridine rouge, le rouge neutre et la thionine permettraient d'étudier les effets de substitution sur l'azote en A, et le violet de méthylène d'étudier la zone B. Ces investigations sont en cours.


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Références

1. DUTRILLAUX B., COUTURIER J. (1972). - Techniques d'ana lyses chromosomiques. In Biologie Génétique, 5-12, L'Expansion scientifique éd., Paris.

2. DUTRILLAUX B., LEJEUNE J. (1975). - New techniques in the study of human chromosomes - Methods and applications. In : Advanc. hum. Genet., 5, p. 129, Plenum Press, New York.