L'analyse par réflexion. Nouvelle méthode d'observation des chromosomes humains

J. LEJEUNE

LEJEUNE J. - L'analyse par réflexion. Nouvelle méthode d'observation des chromosomes humains. Ann. Génét., 1985, 28, n° 1, 67-68.


Résumé :

Des préparations colorées au Giemsa sont éclairées par épi-illumination en lumière blanche. La réflexion sur les chromosomes donne une image très brillante, jaune-vert, assez comparable à la fluorescence après coloration à l'acridine orange. Outre une remarquable stabilité de l'image lors d'observations répétées, cette méthode permet un examen d'une finesse extrême.

Sommaire

Le dispositif microscopique habituel fait appel à une transillumination de préparations colorées. Il est également possible d'utiliser une épi-illumination permettant d'analyser la lumière réfléchie par l'objet.

Haut

Principe

En modifiant un épicondenseur de fluorescence, il est possible de remplacer la source d'ultra-violets par une lampe halogène à incandescence 12 volts 100 watts. Le faisceau lumineux est renvoyé sur la préparation par un réflecteur situé dans l'axe optique du microscope. La lumière réfléchie par l'objet forme ensuite une image microscopique classique.

Il est nécessaire d'éliminer les filtres d'excitation et les filtres d'arrêt et de les remplacer par des diaphragmes appropriés afin d'obtenir une collimation suffisante de la lumière incidente.

Haut

Observation

Une préparation chromosomique classique, colorée au Giemsa (en évitant une surcoloration) est observée à l'objectif x 100 à immersion. Les chromatides apparaissent très brillantes sur un fond quasi-noir. Leur couleur est jaune vif (ou jaune vert en cas d'excès de colorant). A première vue, l'image évoque, en beaucoup plus lumineux, une coloration à l'acridine orange rendue fluorescente par illumination ultra-violette. En plus de sa brillance l'image est d'une complète stabilité et peut être observée à plusieurs reprises, sans détérioration et pendant des temps très prolongés.


Fig. 1. - Analyse par réflexion d'une prométaphase colorée selon la méthode FPG (détail).Fig. 1. - Reflexion analysis of a metaphase after FPG staining (detail).

Haut

Application à la cytogénétique fine

Après une très forte collimation de la lumière incidente, on décèle sur des préparations ordinaires, colorées au Giemsa, un aspect spirale de la surface des chromosomes, à la limite de la visibilité. Les fibres nucléoplasmiques, enserrant les chromosomes dans une sorte de réseau, apparaissent très finement colorées en rouge, contrastant avec la couleur jaune des chromatides. Complétant la méthode précédemment décrite des chromosomes achromiques [1], l'analyse par réflexion permet ainsi d'aborder l'étude fine de ces structures inter-chromosomiques.

Après dénaturation ménagée et coloration au Giemsa, l'analyse par réflexion fait apparaître des bandes R jaune vert brillant et des bandes G de même couleur mais beaucoup plus terne. La définition est excellente et dépasse nettement celle d'une observation en contraste de phase par transillumination.

Après incorporation de BrdU au cours de la dernière phase S, suivie d'une coloration au Giemsa, les bandes R sont jaune clair et les bandes G de couleur bistre, plus terne. Ici aussi la définition est excellente.

Enfin, après synchronisation à la thymidine puis incorporation de BrdU dans la dernière phase S suivie d'une coloration au Hoechst 33258, puis d'une irradiation aux UV et enfin d'une coloration au Giemsa (méthode dite FPG classique) [2] l'examen donne des images remarquables. Les bandes R, jaunes, très brillantes, tranchent sur les bandes G, bistres et ternes. La finesse des détails décelés est nettement supérieure à l'analyse en transillumination, même effectuée en contraste de phase. Il suffit, en effet qu'un détail ait une réflectivité très élevée pour qu'il apparaisse comme un point lumineux ; même si ses dimensions sont inférieures au pouvoir de résolution théorique du microscope (fig. 1).

Cette méthode d'observation très simple, éliminant l'usage délicat d'une fluorescence (souvent insuffisante et toujours éphémère), apporte une grande facilité d'observation, visuelle et photographique.

La qualité des résultats obtenus avec une installation imparfaite dépassent déjà largement, en finesse et en brillance, les meilleures images obtenues en fluorescence classique.

Il semble probable qu'un dispositif mieux adapté permettra d'étendre le champ des applications de cette méthode.


Haut

Références

1. LEJEUNE J., RETHORÉ M.O., BLOIS M.C. de, RAVEL A. - Chromosomes achromiques. Une méthode simple d'observation. Ann Génét. 1984, 27, 4, 257-258.

2. DUTRILLAUX B., COUTURIER J. - La Pratique de l'Analyse Chromosomique. Paris, Masson éd., 1981.