Recombinaison entre le site fragile xq27 et le gène du facteur IX de la coagulation

A. LANDOULSI1, Marie-Christine de BLOIS2, P. GUÉRIN1, Marie-Odile RETHORE2, J. LEJEUNE2, G. LUCOTTE1

LANDOULSI A., BLOIS Marie-Christine de, GUÉRIN P., RE-THORÉ Marie-Odile, LEJEUNE J., LUCOTTE G. - Recom-binaison entre le site fragile Xq27 et le gène du facteur IX de la coagulation. Ann Génét, 1985, 28, n° 4, 201-205.


Résumé :

RÉSUMÉ : La ségrégation du gène du facteur IX (caractérisé par le polymorphisme de restriction d'une sonde Taq I) et celle du site fragile Xq27, sont étudiées dans une famille issue d'un mâle transmet-teur sain. Sur douze méioses informatives on décèle au moins quatre recombinaisons. Cette observation amène à reconsidérer les hypothèses sur une instabi-lité particulière de la région distale du bras long du chromosome X.

Sommaire

Le gène codant pour le facteur IX de la coagula-tion a été récemment cloné (Choo, 1982 ; Kurachi, 1982 ; Jaye, 1983) et, dans diverses populations, un polymorphisme pour un site de restriction Taq 1 a été démontré (Camerino, 1984 ; Giannelli, 1984). A la suite de la publication par Camerino et al. (1983) d'une famille dans laquelle une liaison étroite entre le gène du facteur IX et le site fragile Xq27 parais-sait établie, de nombreuses études de la ségrégation de ces deux marqueurs ont été publiées, révélant tantôt une liaison très étroite (Mattei, 1985 ; Lejeune, 1983 ; Oberle, 1985) tantôt une fréquence élevée de recombinaisons (Davies, 1985 ; Choo, 1984).

Nous rapportons une famille issue d'un " trans-metteur sain " dans laquelle s'observent au moins quatre recombinaisons sur douze méioses informatives.

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Matériel et méthodes

L'ADN long brin est extrait à partir des lympho-cytes des membres de la famille selon la méthode de Gautreau et coll. (1983). Chaque échantillon d'ADN est digéré par l'enzymede restriction Taq 1 en excès de 5 unités par µg et selon les normes indi-quées par le fabricant. Les fragments de restriction sont ensuite séparés sur gel d'agarose horizontal à 0,8 % et transférés sur filtre Zétabind selon la mé-thode de Southern (1975) modifiée.

La sonde du facteur IX utilisée est un sous-clone Eco RI/Hind III du gène (Giannelli, 1984) conte-nant l'exon d. Cette sonde a été marquée par dépla-cement de coupure (Rigby, 1977) au dCTP - 32P, puis séparée des nucléotides libres sur colonne Sephadex G-50. Nous avons obtenu régulièrement des activités spécifiques de l'ordre de I - 3 x 107 cpm/µg.

Après préhybridation du filtre, l'hybridation a été réalisée pendant 20 heures à 42°C au bain-marié or-bital dans une solution : 5 x SSC, I x Denhardt, 0,02 M de Na PO4, pH = 6,7, 100 µg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé, 10 % de sulfate de dextran, 50 % de formamide désionisée, et contenant la sonde marquée et dénaturée. Les la-vages sont réalisés jusqu'à 0,1 % SDS et 0,1 SSC à 60°C. Après séchage, le filtre est enfin autoradiographie à -70°C pendant 3 à 10 jours dans une cas-sette contenant deux écrans intensificateurs.

Pour chaque sujet, l'analyse cytogénétique sur les lymphocytes en culture a porté sur 200 mitoses dont 100 ont été cultivées en présence de triméthoprime (Le jeune, 1982).


Fig. 1.

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Résultats

La figure 1 représente une partie de la famille IP n° 14205 dans laquelle on observe la ségrégation du site fragile Xq27. La fratrie (V, 1, 2, 3, 4) et les fra-tries (IV, 3, 4, 5, 7, 9, 10), (IV, 11,12,13,14,15) et (IV, 16, 17, 18, 20, 21) sont reliées entre elles par l'intermédiaire de deux hommes : III, 3 et II, 3. Il s'agit donc d'une transmission du site fragile par des hommes " transmetteurs sains ".

Le sujet III, 3, âgé de 77 ans est d'une intelligence normale et ne présente aucun trouble du caractère. Il a exercé avec succès de grandes responsabilités. Son phénotype est tout à fait normal et on ne décèle pas de macroorchidie. Il a été très difficile de mettre en évidence chez lui la fragilité du chromosome X. Trois lacunes seulement, typiques de la zone Xq27. ont été observées sur un total de 528 mitoses, même après adjonction de triméthoprime au milieu de culture.

Ses deux frères, III, 1 et III, 2, maintenant décé-dés, étaient atteints de débilité mentale grave avec troubles du comportement. Leur aspect, étudié sur photographies de famille, évoque une étroitesse de la face avec grand menton. D'après leur sœur III, 5 (elle-même normale et non porteuse de lacune), leur comportement était tout à fait comparable à celui des autres sujets atteints de cette famille, tels V, 1 et V,2.

Il ne peut donc faire de doute que le sujet III, 3 soit un mâle " transmetteur sain " d'autant plus que outre sa fille IV, 2 il a donné naissance à deux autres filles porteuses de l'X fragile ayant elles-mêmes donné naissance à des garçons débiles mentaux por-teurs de la fragilité de l'X (non représentés sur l'ar-bre généalogique de la figure 1).

Sa fille IV, 2 est porteuse de la fragilité de l'X. De ses quatre enfants, les deux garçons V, 1 et V, 2 sont débiles mentaux et porteurs de la fragilité de l'X ; la fille V, 3 est normale, non porteuse de la la-cune et la fille V, 4, porteuse de la lacune, souffre d'un retard scolaire important bien que son quotient intellectuel soit normal.

L'examen du polymorphisme Taq 1 du facteur IX (fig. 2) montre que IV, 2 est de génotype (1.1) (voir tableau 1 pour l'ensemble des données recueillies).

De ce fait, tous ses enfants reçoivent d'elle un allèle 1 et cette fratrie ne donne aucune information sur la ségrégation du gène du facteur IX par rapport à la fragilité de l'X.

Toutefois, IV, 2 ayant reçu de son père III, 3 la fragilité de l'X et l'allèle 1, on peut en conclure que le chromosome X de III, 3, portait nécessairement les deux marqueurs.

Le sujet II, 3, décédé, n'a pu être examiné ; son intelligence et son insertion sociale étaient tout à fait normales. Ses filles III, 7, III, 9 et III, 13 sont toutes trois " porteuses obligatoires " bien que la lacune Xq27 n'ait pu être mise en évidence ; toutes trois ont le génotype 1.2. Il est donc plausible qu'elles aient toutes trois reçu l'allèle 1 et la fragilité de l'X de leur père II, 3.

De ce fait, III, 3 et son oncle maternel II, 3 au-raient tous deux porté sur leur chromosome X la combinaison allèle 1 et facteur de fragilité. On pour-rait en déduire que cette combinaison était réalisée aussi chez l'ancêtre I, 1 et que la méiose ayant donné naissance à II, 2 et celle ayant donné naissance à III, 3 ainsi que celle ayant donné naissance à II, 3 n'ont pas donné lieu à une recombinaison entre les deux marqueurs. Cette inférence est cependant trop incertaine pour être prise en considération.

De toutes façons, aucune recombinaison ne pou-vant se produire sur l'X d'un mâle (sauf à admettre un remaniement de structure), les trois sœurs III, 7, III, 9 et III, 13 auraient un chromosome X porteur de l'allèle 1 et de la fragilité (1,F), venu de leur père et un chromosome X porteur de l'allèle 2, sans fragi-lité (2,N) venu de leur mère, c'est-à -dire seraient double hétérozygotes (1,F/2,N).

Parmi les enfants de III, 7, le garçon IV, 10 est débile mental, porteur de la fragilité de l'X et de génotype 1 ; il a donc reçu l'X (1,F).

Le garçon IV, 7, bien portant et de génotype 2 a reçu de sa mère l'X (2,N). Sa sœur IV, 4 porteuse de la fragilité et de génotype 1.2, a reçu l'X (1,F) de sa mère et l'X (2,N) de son père.

La fille IV, 9, elle aussi de génotype 1.2 devrait donc avoir reçu la même combinaison. Or, elle ne manifeste pas la lacune et son développement men-tal est normal. Il s'agit donc vraisemblablement d'une recombinaison mais le fait que des femmes transmettrices puissent ne pas manifester la lacune nous fait considérer ce cas comme incertain.

La mère III, 9 transmet à sa fille IV, 13 la fragilité de l'X et l'allèle 1 ; cette dernière est donc de géno-type (1,F/1,N), puisque son père, III, 10, ne peut lui transmettre que l'allèle 1. Il en est de même pour la fille IV, 15.

En revanche, le fils IV, 11, débile mental porteur de la lacune et la fille IV, 12, reçoivent tous deux de leur mère la fragilité et l'allèle 2. Ils sont donc tous deux des recombinants.

On ne peut supposer que III, 9 soit de génotype (1,N/2,F) car il faudrait admettre un remaniement de l'X chez son père II, 3. Dans cette éventualité hautement improbable, IV, 13 et IV, 15 seraient d'ailleurs des recombinants.

La mère III, 13 transmet à sa fille IV, 17, l'allèle 2 et la fragilité de l'X ; en effet, le sujet III, 14 décédé et non examiné était nécessairement porteur du gène 1 puisque sa fille IV, 20 est homozygote (1,1) ; IV, 17 a donc reçu (2,F) de sa mère et (1,N) de son père. De même, IV, 16, débile mental porteur de la lacune, a reçu de sa mère la combinaison (2,F). Ils sont donc tous deux des recombinants.

En revanche, IV, 20, débile mentale et porteuse de la lacune, a reçu (1,F) de sa mère et (1,N) de son père et IV, 21, garçon bien portant et non porteur de la lacune, a reçu (2,N) de sa mère. Il n'y a donc pas de recombinaison.

L'éventualité d'un génotype (2,F/1,N) chez III, 13, déjà rejetée pour III, 7, ne changerait nullement ces proportions.


Fig. 2. - Exemples des différents génotypes pour le facteur IX. Les hommes peuvent être hémizygotes soit pour 1, soit pour 2 ; les femmes peuvent être soit homozygotes 1, soit homozygotes 2 (cas non représentés), soit hétérozygotes 1-2.Fig. 2. - Examples of the different factor IX genotypes. The men may be hemizygous for 1 or for 2 ; the women may be homozygous 1 or homozygous 2 (non represented cases), or heterozygous 1-2.

TABLEAU I. - Age, niveau mental et analyse caryotypique des différents membres de la généalogie. La désignation de chaque individu se rapporte à la figure 2 qui indique de plus le sexe et les a allèles au gène du facteur IX, l'âge est donné en années ; les caryotypes non-commentés n'ont pas été ef-fectués.
SujetAgeNiveau mentalCaryotype et % de X-fragile
III377normal-1 %
III476normal
III575normalnormal
III660normal
II1759normalnormal
III860normal
III953normalnormal
III1055normal
III1149normal
III1245normal
III1347normalnormal
IV147normal
IV247normal3%
IV433limite4%
IV531normalnormal
IV729normal
IV927normalnormal
IV1023débile4%
IV1128débile13%
IV1227limite13%
IV1323débile léger7%
IV1419normalnormal
IV1513débile3%
IV1625débile34%
IV1724limite10%
IV1823normal
IV2019limite5%
IV2115normalnormal
V125débile20%
V223débile40%
V319normalnormal
V417trouble du comportement
V5normalnormal
V6normalnormal
V7normalnormal
V8normalnormal

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Discussion

La liaison entre le gène du facteur IX et le site fragile Xq27 fut tout d'abord tenue pour extrêmement étroite (Camerino, 1983) et une application au diagnostic précoce de l'affection fut même envisa-gée. L'accumulation des données (Brown, 1985 ; Choo, 1984 ; Davies, 1985 ; Mattei, 1985 ; Oberle, 1985 ; Pembrey, 1985 ; Szabo, 1984 ; Tommerup, 1985 ; Warren, 1985) fit rejeter cette hypothèse. En ajoutant notre observation à celles déjà citées, on arrive en effet à estimer que le pourcentage de re-combinaisons entre le site fragile Xq27 et le facteur IX est de l'ordre de 20 %.

Il reste que les familles publiées révèlent une forte hétérogénéité et plusieurs explications ont été pro-posées. Remarquant que, dans les familles porteuses de la fragilité, la liaison entre les gènes 52 A et fac-teur IX (tous deux proches du site Xq27 (Davies, 1985 ; Mattei, 1985 ; Mulligan, 1985 ; Purrello. 1985) paraît plus faible que dans la population géné-rale, Davies et coll. (1985) discutèrent une hétérogé-néité locale de la zone proche du site fragile. De leur côté, Brown et coll. (1985) proposèrent qu'il pourrait exister une liaison particulièrement étroite dans les familles issues d'un " mâle transmetteur sain ". Cette éventualité qui rappelle l'hypothèse d'une " prémutation " proposée par Pembrey (1985) n'est pas en accord avec notre observation qui ré-vèle, au contraire, un taux de recombinaison élevé dans une famille issue d'un mâle " transmetteur sain ".

Des méthodes statistiques permettent certes de tester l'hétérogénéité d'une liaison mais leur applica-tion (Brown, 1985) ne nous paraît pas susceptible de trancher la difficulté. Tous les raisonnements repo-sent, en effet, sur un postulat implicite : " le facteur génétique, responsable de la débilité mentale et de la fragilité de l'X est situé sur la bande Xq27 ".

Avant de fonder les calculs sur ce postulat, il nous semble prudent de ne pas exclure a priori une autre possibilité selon laquelle la lacune serait en quelque sorte le " souvenir " d'une intense activité locale de transcription d'ARN messager (Lejeune, 1983). Si cette transcription se prolongeait lorsque la réplication de l'ADN est déjà commencée, elle entraînerait un retard de condensation locale, d'où la lacune ob-servable. Or, on sait que les bouffées d'ARN (an-neaux de Balbiani des chromosomes géants des dip-tères) peuvent être provoquées par l'activité ou la non-activité de gènes qui ne sont pas situés sur la zone excitée.


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